Dieses Protokoll kann zum Nachweis und zur Charakterisierung von Proteinkonformationsdynamiken verwendet werden, die für das Verständnis einer Vielzahl von zellulären Prozessen unerlässlich sind. Im Vergleich zu anderen Methoden erfordert diese Methode keine speziellen Probenvorbereitungsschritte und bietet eine umfassende Charakterisierung der Kinetik, Thermodynamik und strukturellen Aspekte des bestätigungsweisen Gleichgewichts. CpMG-Relaxationsdispersion kann breiter zur Charakterisierung der Bestätigungsdynamik in Nukleinsäuren und anderen Biomolekülen sowie zur Charakterisierung von Liganden-Nanopartikel-Interaktionen eingesetzt werden.
Unser Protokoll richtet sich an CPMG-Erstanwender. Es ist also ein guter Ausgangspunkt. Wir erwarten jedoch, dass die Benutzer die grundlegenden Schritte für die Durchführung herkömmlicher NMR-Experimente kennen.
Um ein NMR-Experiment zum ersten Mal einzurichten, laden Sie zuerst diese zusätzlichen Dateien herunter und entpacken Sie sie. Kopieren Sie die Bits. vv und trosy_15N_CPMG.
vv-Dateien im pulse-Programmordner in das pulse-Programmverzeichnis. Öffnen Sie die Erfassungssoftware und verwenden Sie den EDC-Befehl, um ein zuvor ausgeführtes Wasserstoffstickstoff-15-HSQC-Experiment in ein neues Experiment zu kopieren. Verwenden Sie den Befehl pulse program, um die trosy_15N_CPMG zu laden.
vv Pulsprogrammdatei in das neu erstellte Experiment. Verwenden Sie dann die Anweisungen am Ende der Pulsprogrammdatei, um das CPMG-Experiment einzurichten. Um ein routinemäßiges NMR-Experiment einzurichten, führen Sie die Probe in den Magneten ein und führen Sie alle grundlegenden NMR-Erfassungsschritte durch.
Stellen Sie P1 auf die Dauer der wasserstoffharten 90-Grad-Impulse und P7 auf die Dauer Stickstoff 15 harte 90-Grad-Impulse ein. Legen Sie im Erfassungsfenster die Mittlere und Spektralbreite für die Dimensionen Wasserstoff und Stickstoff 15 fest. Setzen Sie die Relaxationsverzögerung auf 0,7 T2 und verwenden Sie den Vc-Listenbefehl, um eine Liste ganzzahliger Zahlen zu erstellen, die N entsprechen.Nachdem Sie bestätigt haben, dass jeder Eintrag in der Liste einem anderen CPMG-Feld entspricht, gemäß CPMG-Datei gleich 4N geteilt durch D30, überprüfen Sie, ob die erste Zahl in der Liste Null ist.
Legen Sie L8 auf die Anzahl der Einträge in der VC-Liste, L3 auf die Anzahl der reellen Punkte für die indirekte Dimension und 1TD auf L8 mal L3 mal zwei fest. Um die Wasserunterdrückung zu optimieren, stellen Sie die Empfängerverstärkung auf eins und geben Sie EDC pull ein, um die Impulsprogrammdatei zu öffnen. Entfernen Sie in Zeile 91 das Semikolon vor Goto 999, und speichern Sie die Datei.
Passen Sie mit dem GS-Befehl die SPDB0-Parameter an, um die Intensität des FID-Signals zu minimieren. Wenn die Signalintensität geändert wurde, setzen Sie in Zeile 91 der Impulsprogrammdatei wieder ein Semikolon ein und speichern Sie die Datei. Um SPDB11 zu optimieren, stellen Sie die Empfängerverstärkung auf eins und den Typ EDC pull ein, um die Impulsprogrammdatei zu öffnen.
Entfernen Sie in Zeile 168 das Semikolon vor Goto 999, und speichern Sie die Datei. Passen Sie mit dem GS-Befehl die SPDB11-Parameter an, um die Intensität des FID-Signals zu minimieren. Wenn die Signalintensität geändert wurde, setzen Sie das Semikolon in Zeile 168 wieder ein und speichern Sie die Datei.
Um SPDB2 zu optimieren, stellen Sie die Empfängerverstärkung auf eins und geben Sie EDC-Pull ein, um die Impulsprogrammdatei zu öffnen. Entfernen Sie in Zeile 179 das Semikolon vor Goto 999, und speichern Sie die Datei. Passen Sie mit dem GS-Befehl die SPDB2-Parameter an, um die Intensität des FID-Signals zu minimieren.
Wenn die Signalintensität geändert wurde, führen Sie das Semikolon in Zeile 179 der Impulsprogrammdatei wieder ein und speichern Sie die Datei. Um PLDB2 zu optimieren, stellen Sie die Empfängerverstärkung auf eins und geben Sie EDC-Pull ein, um die Impulsprogrammdatei zu öffnen. Entfernen Sie in Zeile 184 das Semikolon vor Goto 999, und speichern Sie die Datei.
Passen Sie mit dem GS-Befehl die PLDB2-Parameter an, um die Intensität des FID-Signals zu minimieren. Wenn die Signalintensität geändert wurde, setzen Sie das Semikolon in Zeile 184 der Impulsprogrammdatei wieder ein und speichern Sie die Datei. Führen Sie den RGA-Befehl aus, um die Empfängerverstärkung zu optimieren.
Führen Sie dann den Befehl ZG aus, um das Experiment zu starten. In dieser Abbildung können die Ergebnisse der Relaxationsdispersionsprofile beobachtet werden, die für jeden Peak im Wasserstoffstickstoff-15-Trosy-Spektrum erfasst wurden. Aus den erworbenen Relaxationsdispersionsprofilen ist es möglich, den Austauschbeitrag zur Stickstoff-15-Querrelaxation jeder Backbone-AMI-Gruppe abzuschätzen.
Durch die Darstellung der Querrelaxation auf der 3D-Struktur des untersuchten Proteins ist es möglich, die strukturellen Regionen, die sich einem Bestätigungsaustausch auf der Mikrosekunden-Millisekunden-Zeitskala unterziehen, zu identifizieren. Die Modellierung der Relaxationsdispersionskurven mit den Carver-Richards-Gleichungen liefert die thermodynamischen und kinetischen Parameter des Austauschprozesses, wie die fraktionierten Populationen der Gleichgewichtszustände und die Wechselkursrate zwischen diesen Zuständen. Die Temperaturabhängigkeit dieser thermodynamischen und kinetischen Parameter kann dann mit den van't Hoff- bzw. I-Ring-Gleichungen modelliert werden, um detaillierte Informationen über die Energetik des Bestätigungsaustauschs zu erhalten.
Es ist entscheidend, alle Erfassungsparameter, insbesondere P7, sorgfältig zu optimieren. Es ist auch wichtig, hochreine und homogene Proben herzustellen, um falsche Dispersionen zu vermeiden. Die kinetischen, thermodynamischen und chemischen Chipparameter, die mit diesem Protokoll erhalten werden, können verwendet werden, um energetische und strukturelle Informationen über die Spezies abzuleiten, die den Bestätigungsaustausch durchlaufen. Die Charakterisierung der mit CPMG-Methoden gewonnenen Proteinbestätigungsdynamik liefert entscheidende Informationen zum Verständnis von Signalen und enzymatischer Aktivität sowie neue Perspektiven für das Wirkstoffdesign.
