Die Technik der paramagnetischen Relaxationsverstärkung kann verwendet werden, um intermolekulare Abstände zu charakterisieren und zu messen und transiente und/oder niedrig besiedelte biomolekulare Wechselwirkungen zu quantifizieren. Hier haben wir diese Technik angewendet, um Wechselwirkungen zu erfassen, die der Proteinkondensation vorausgehen. Die Empfindlichkeit von PREs ermöglicht die Identifizierung, Detektion und Quantifizierung dynamischer Zustände mit atomarer Auflösung, die für andere NMR-Techniken unsichtbar und unzugänglich bleiben.
Zu den wichtigsten Schritten in diesem Protokoll gehören das Entfernen der unkonjugierten Nitroxid-Spin-Markierung und die sorgfältige Analyse der Spektren, um die Peakhöhe genau zu messen. Darüber hinaus ist beim Aufbau des NMR-Experiments und der Pulskalibrierung Vorsicht geboten. Zu Beginn wird 3-Maleimido-PROXYL aus einer Stammlösung mit dem 20-fachen molaren Überschuss des 15N-isotopenmarkierten Proteins von Interesse zugegeben.
Über Nacht bei Raumtemperatur oder vier Grad Celsius licht- und sauerstoffgeschützt und mit leichtem Schaukeln oder inkubieren. Entfernen Sie am nächsten Tag das nicht umgesetzte Freidrehetikett, um eine unspezifische Lösungsmittel-PRE zu verhindern, indem Sie entweder eine umfangreiche Dialyse der Proteinprobe oder eine Gelfiltration durchführen. Verwenden Sie dann das Ellman-Reagenz, um freie Sulfhydrylgruppen in der Lösung zu quantifizieren.
Messen Sie die Extinktion mit einem Mikroplatten-Reader und konstruieren Sie die Standardkurve. Um intramolekulare PRE zu messen, wird das mit 15N isotopisch angereicherte Spin-markierte Protein in einer Konzentration von mindestens 100 Mikromolaren, aber nicht mehr als 300 Mikromolaren in einem für NMR geeigneten Puffer hergestellt. Anschließend wird die NMR-Probe mit einer langen Glaspipette oder Mikropipette in ein fünf Millimeter großes NMR-Röhrchen überführt, das für den Einsatz in Hochfeldmagneten geeignet ist.
Legen Sie die Probe in den Magneten. Sperren Sie das Deuteriumsignal mit dem Befehl lock und stimmen Sie den Protonenkanal gemäß den Protokollen der Einrichtung ein und passen Sie ihn an. Passen Sie dann die Unterlegscheiben mit der Unterroutine für die obere Unterscheibe an, um die Unterdrückung des Lösungsmittelsignals zu optimieren.
Kalibrieren Sie anschließend den Protonenpuls mit dem P-OPT-Programm. Kalibrieren Sie dann den 15-N-Impuls gegen eine Standardprobe. Bestimmen Sie die richtige Dämpfung für geformte Impulse mit dem Unterprogramm des Formwerkzeugs.
Öffnen Sie dann die entsprechende Pulsformdatei, indem Sie auf das Ordnersymbol klicken. Die geformten Pulse finden Sie im Abschnitt Pulsparameter der Erfassungsparameter. Nachdem Sie die Impulsdefinitionsdatei geladen haben, klicken Sie auf "Wellenform analysieren" und dann auf "Form integrieren".
Geben Sie den kalibrierten 90-Grad-Hartpuls des Protons, die gewünschte Form, die Pulslänge und die Drehung ein. Berechnen Sie dann den Leistungspegel des geformten Impulses, indem Sie die Änderung des Leistungspegels zur Dämpfung für den kalibrierten 90-Grad-Impuls addieren. Nehmen Sie ein Standard-Proton 15N HSQC auf, um die Sweep-Breite und die Ladungsträgerfrequenz zu optimieren und die Wasserunterdrückung zu überprüfen.
Passen Sie abschließend die Sweep-Breite und die Anzahl der indirekten Bemaßungsschritte mit den Befehlen SW und TD oder direkt in den entsprechenden Dialogfenstern an. Kalibrieren Sie die geformten Impulse, wie zuvor gezeigt. Geben Sie dann die kalibrierten Impulslängen im Abschnitt "Impulsparameter" auf der Registerkarte "Erfassungsparameter" ein.
Um das Amid-Proton T2 mit dem Zwei-Zeitverzögerungspunkt-Ansatz zu messen, stellen Sie die Zeitverzögerungen ein, indem Sie die VD-Listendatei bearbeiten. Die erste Verzögerung ist auf 0,01 Millisekunden festgelegt. Wählen Sie unter Verwendung der Beziehung zum erwarteten maximalen PRE die zweite Verzögerung aus.
Dann wird ein geeigneter Wert bestimmt, indem man die ersten Inkremente des ersten und zweiten Verzögerungsspektren vergleicht und die zweite Verzögerung so einstellt, dass das Signal auf 40 bis 50 % seines Anfangswertes abklingt. Bestimmen Sie die Anzahl der aufzuzeichnenden komplexen Punkte und die Anzahl der Scans für eine ausreichende Signalmittelung. Berechnen Sie dann mit dem Befehl EXPT die Versuchszeit und starten Sie das Experiment mit dem Befehl ZG. Nachdem Sie Natriumascorbat im NMR-Puffer gelöst haben, passen Sie den pH-Wert an den des ursprünglichen NMR-Puffers an.
Dann wird die Ascorbinsäure mit einem 10-fachen molaren Überschuss über der Konzentration der Spin-Markierung in das NMR-Röhrchen gegeben, indem ein Tröpfchen unter den Rand des Röhrchens gelegt wird. Verschließen Sie das Röhrchen und drehen Sie es vorsichtig um, um es zu mischen. Bei 200 bis 400 G 10 bis 20 Sekunden lang in einer handgekurbelten Zentrifuge schleudern, um die Probe am Boden des Röhrchens abzusetzen.
Nachdem Sie das Röhrchen in Folie eingewickelt haben, lassen Sie die Reaktion mindestens drei Stunden lang laufen. Dann wird das Amid-Proton T2 auf der diamagnetischen Probe mit den gleichen Parametern aufgezeichnet, die für die paramagnetische Probe verwendet werden. Intramolekulare Amid-Protonen-gamma-PREs wurden auf einem selbst-assoziierenden, intrinsisch ungeordneten Fragment aufgezeichnet, das von der Domäne mit geringer Komplexität des RNA-bindenden Proteins EWSR1 abgeleitet ist.
Es wird erwartet, dass Rückstände in unmittelbarer sequentieller Nähe des Spin-Markierungspunktes signifikant verbreitert sind und im Spektrum nicht nachweisbar sind. Reste, die sequenziell vom Bindungspunkt entfernt waren, aber ein erhöhtes Gamma aufwiesen, befanden sich räumlich nahe an der Spinmarkierung. Im Falle von intrinsisch ungeordneten Proteinen liefert die Aufzeichnung und Analyse von Pürees Informationen über intramolekulare Kontakte und transiente Interaktionsflächen.
Die Kombination von PRE-Messungen mit anderen biophysikalischen Methoden wie dynamischer Lichtstreuung, Größenausschlusschromatographie, analytischer Ultrazentrifugation und computergestützten Methoden kann tiefere Einblicke liefern. Die PRE-Messung hilft bei der Charakterisierung von transienten, dünn besiedelten Zuständen. Dieser Ansatz könnte erweitert werden, um Wechselwirkungen zu charakterisieren, die für unzählige biologische Prozesse wichtig sind, wie z. B. molekulare Erkennung, allosterische Konformationsselektion und Assemblierungsprozesse, einschließlich des Zusammenbaus membranloser Organellen durch Phasentrennung.
