Das folgende Protokoll zeigt, wie man ein Neutronen-Spin-Echo-Experiment aufbaut, um die Zwischenstreufunktion zu messen und die Dynamik von Proteinen in Lösung zu untersuchen. Der Hauptvorteil der Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie ist ihre Fähigkeit, die Neuanordnung von Proteindomänen und Subdomänen auf der Pico-zu-Nanosekunden-Zeitskala zu untersuchen, was der Bereich der Zeitlupe in Proteinen in ihrer fast natürlichen Umgebung und in der überfüllten Proteinlösung ist. Neutron Spin Echo ist auch empfindlich gegenüber der Isotopenkonfiguration, was sehr spezifische und gezielte Studien mit Kontrastabgleich ermöglicht.
Einblicke in die Dynamik der Proteindomäne sind ein wichtiger Teil der biophysikalischen Forschung in der anhaltenden schwierigen Aufgabe, die Domänenbewegungen der Proteine mit ihrer biologischen Funktionalität zu kommunizieren. Das hier vorgestellte Protokoll kann im Allgemeinen auf jede Neutronen-Spin-Echo-Messung angewendet werden, die am SNS-NSE-Spektrometer durchgeführt wird, unabhängig von der Wahl der Proben, wenn man sich im Bereich der Materialien für weiche Materie aufhält. Um das Experiment einzurichten, wählen Sie zunächst die Dicke der Zellprobenladung aus, basierend auf der Konzentration der Proteinprobe, der für die Messung erforderlichen Temperatur und der verfügbaren Lösungsmenge.
Reinigen Sie die Zelle mit phosphatfreiem Geschirrspülmittel, deionisiertem Wasser und 70% Diethanol. Trocknen Sie die Zelle im Konvektionsofen. Laden Sie vier Milliliter Proteinlösung in die Zelle und schließen Sie sie mit Kappen.
Verwenden Sie Wachsfilm oder ein anderes Dichtmittel, um die Probenzellen zu versiegeln. Vier Milliliter Dialysepuffer in einen identischen Behälter wie die Proteinprobe geben und versiegeln. Transportieren Sie die Proben zur Balkenlinie.
Schließen Sie den Verschluss und betreten Sie den Höhlenbereich des Spektrometergehäuses. Montieren Sie die Probenzelle auf dem Aluminium-Probenhalter, indem Sie die Schrauben und die Halteplatten festziehen. Montieren Sie die Graphitprobe und die Aluminiumoxidpulverprobe, die in einem identischen Behälter wie die Proteinprobe geladen sind.
Platzieren Sie den gleichen Halter, indem Sie ihn vorsichtig in die Dose des Temperaturantriebssystems schieben. Schließen Sie den Deckel des Temperaturantriebssystems und stellen Sie die Temperatur auf den gewünschten Wert ein, indem Sie auf den interaktiven Bildschirm des Temperaturantriebssystems zugreifen. Montieren Sie die Neutronenkamera für die Ausrichtung der Proben am Strahl.
Um die Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie-Daten zu sammeln, richten Sie die Probe im Neutronenstrahl mit der Neutronenkamera und den vier unabhängigen Probenöffnungen aus. Öffnen Sie die Spallations-Neutronenquelle, die Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie-Datenerfassungssoftware, und sammeln Sie Probenstatistiken, indem Sie Bruchscans für die gewünschten Streuwinkel und Wellenlängen durchführen. Richten Sie die Messparameter basierend auf den für jede Probe gesammelten Statistiken ein, indem Sie die vom Assisting Instrument Scientist bereitgestellten Messmakros bearbeiten.
Starten Sie den Scan, indem Sie den Protokollnamen an der Eingabeaufforderung eingeben und Echos für das Beispiel erfassen. Melden Sie sich mit den ORNL-Benutzeranmeldeinformationen beim Neutron Sciences Remote Analysis-Cluster an und drücken Sie die Schaltfläche Sitzung starten. Öffnen Sie im Benutzerverzeichnis ein Terminalfenster und geben Sie den Befehl software setup ein.
Geben Sie als Nächstes den Umgebungsbefehl ein. Erstellen Sie einen Ordner für die Datenreduktion im Basisverzeichnis und kopieren Sie die bereitgestellten Skripts und Makros aus dem freigegebenen Verzeichnis. Bearbeiten, umbenennen und speichern Sie das bereitgestellte Reduktionsmakro entsprechend.
Geben Sie drspine" an der Eingabeaufforderung ein und drücken Sie die Eingabetaste, um die Softwarereduktionsumgebung zu starten. Geben Sie den Namen des Reduktionsmakros in die Eingabeaufforderung in der Softwareumgebung ein, und drücken Sie die EINGABETASTE. Bearbeiten Sie das vom Assisting Instrument Scientist bereitgestellte Python-Skript mit den Namen der reduzierten Dateidaten.
Bearbeiten Sie die Funktion so, dass sie aus der bereitgestellten Bibliothek passt. Geben Sie den Namen des bearbeiteten Skripts an der Eingabeaufforderung ein, und drücken Sie die EINGABETASTE, um reduzierte NSE-Daten zu lesen, anzupassen und zu plotten. Die von NSE gemessene Zwischenstreufunktion für IgG- und MBP-Proteine zeigt eine deutliche Abweichung von einem einfachen diffusionsähnlichen Relaxationsprozess auf der kurzen Vier-Jahres-Zeitskala, was auf die Zugänglichkeit der internen Dynamik von Proteinen durch NSE und die Notwendigkeit eines komplexeren Modells zur Beschreibung der beobachteten dynamischen Prozesse hinweist.
Die Ergebnisse von Berechnungen der Zwischenstreufunktionen, die durch atomare Modellierung beider Proteine unter Verwendung von Modellen von entwickelt wurden, stimmten hervorragend mit den experimentellen NSE-Daten überein. Die Ergebnisse zeigten, dass eine langsamere Dynamik, die bei längeren Kürschnerzeiten beobachtet wird, auf die gesamten translationalen und rotationalen Diffusionsprozesse zurückzuführen ist, während die auf den kurzen Zeitskalen beobachtete Dynamik auf die Dynamik von Proteindomänen zurückzuführen ist. Eine wichtige Sache, an die man sich erinnern sollte, ist der Bedarf an gut vorbereiteten und sauberen Proben für NSE-Messungen.
Ein gutes Sample für ein Spin Echo hat ein Flip-Verhältnis von mehr als drei, was dem Verhältnis zwischen kohärenter und inkohärenter Streuung des Samples entspricht. Auch während der Probenvorbereitung und des Ladens der Proben in die NSE-Zellen sollte die Probenlösung sicher und frei von chemischen oder biologischen Kreuzkontaminationen aufbewahrt werden. Aus Sicherheitsgründen sollte der Eintritt in das Spektrometergehäuse erst nach dem Schließen des Verschlusses versucht werden, und es wurde eine zusätzliche halbe Stunde Zeit für die Strahlungskühlung des Gehäuses eingeräumt.
Die Kleinwinkel-Neutronenstreuung wird empfohlen, um die Form und die Struktur von Proteinen in einer konzentrierten Lösung zu beurteilen. Es kann vor oder parallel zum NSE-Experiment durchgeführt werden. Zusätzliche Methoden wie dynamische Lichtstreuung und Viskositätsmessungen liefern Informationen über die translationale Diffusion und die hydrodynamische Wechselwirkung innerhalb der konzentrierten Proteinlösung und werden ebenfalls empfohlen.
