Diese Arbeit wurde durch den internen Forschungsfonds der George Mason University unterstützt.

1. Virus- und Viruspartikel-Assemblierung
<ol><li>Vektoren: Kaufen Sie Expressionsvektoren für SARS-CoV-2 M, E oder N sowie SARS-CoV-2 S (Wildtyp, Wt), Delta (B.1.617.2) und Omikron (B.1.1.529) kommerziell. HINWEIS: Proteinsequenzen der Expressionsvektoren sind in der Zusatzdatei 1 enthalten. Den Anbieter dieser Expressionsvektoren finden Sie auch unter der Materialtabelle.</li>
	<li>Zellen und Zellkultur: Halten Sie HEK293T Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FBS), 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin. HINWEIS: Alle Zellkulturarbeiten müssen in einer Biosicherheitswerkbank mit laminarem Luftstrom durchgeführt werden. Die Transfektion von Polyethylenimin (PEI) erfordert typischerweise eine Inkubationszeit von 5-6 Stunden. Die Startzeiten müssen im Vorfeld genau abgewogen werden.</li>
	<li>Virusassemblierung und PEI-basierte Kotransfektion: Assemblierung von Ha-CoV-2-Partikeln durch Kotransfektion HEK293T Zellen. Keimzellen in einer 10 cm Zellkultur-Petrischale (4-5 x 106 Zellen pro Schale) in 10 ml vollständigem DMEM-Medium am Tag vor der Kotransfektion. Für diese Studie werden drei Petrischalen verwendet, um Zellen für den Zusammenbau von Ha-CoV-2-Wildtyp, Delta bzw. Omicron zu säen.</li>
	<li>Petrischalen über Nacht in einem CO2 -Inkubator bei 37 °C inkubieren. Überprüfen Sie das Geschirr am nächsten Morgen, um sicherzustellen, dass die Zellen zu 80 % zusammenfließen. Entfernen Sie das gesamte Medium und ersetzen Sie es durch 9 ml DMEM-serumfreies Medium.</li>
	<li>Bereiten Sie für jedes Gericht eine Cotransfektionsmischung mit jeweils 2,5 μg der SARS-CoV-2-Strukturproteinexpressionsvektoren (N, E, M), 10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (HaCoV2-Genom) und 2,5 μg des S-Proteinexpressionsvektors, entweder der Delta- oder der Omicron S-Variante, und 45 μl PEI-basiertem Transfektionsreagenz zu. Lassen Sie die Cotransfektionsmischung durch 13 min Inkubation komplexe bilden (nicht länger als 30 min inkubieren).</li>
	<li>Nach der Inkubation die Cotransfektionsmischung langsam und tropfenweise in jede Petrischale geben. Stellen Sie das Geschirr für 6 h bei 37 °C in einen CO2 -Inkubator. Entfernen Sie nach 6 h serumfreies DMEM und ersetzen Sie es durch vollständiges DMEM-Medium. Ernte des Virus 48-60 Stunden nach der Kotransfektion.</li>
	<li>Virusernte und -lagerung: Ernte der Partikel 48 Stunden nach der Kotransfektion. Trennen Sie die Zellen durch wiederholtes Pipettieren über die Oberfläche der Monoschicht und sammeln Sie Zellen aus jeder Schale, geben Sie sie in 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 400 x g . Der Überstand wird aufgefangen und durch einen 0,22-μM-Filter geleitet. Lagern Sie das Ha-CoV-2-Pseudovirus bei -80 °C.</li>
</ol>2. Viraler Infektiositätstest
<ol><li>Zellen und Zellkultur: Halten Sie HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin.</li>
	<li>Aussaat HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen: Am Tag vor dem viralen Infektiositätstest HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen in einer 96-Well-Platte in 50 μl vollständigem DMEM-Medium säen. Für jede 96-Well-Platte werden 2,5 x 104 Zellen in jede Vertiefung gesät, und für eine Platte werden insgesamt 2,5 x 106 Zellen benötigt. Stellen Sie die 96-Well-Platte über Nacht bei 37 °C in einen CO2 -Inkubator.</li>
	<li>Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Verwenden Sie Ha-CoV-2-Variantenpartikel, um HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen zu infizieren. Entfernen Sie am Morgen der Infektion 50 μl DMEM aus der vorgesäten 96-Well-Platte. Ersetzen Sie das Medium durch 50 μl Ha-CoV-2 Wildtyp, Delta oder Omikron für 18 Stunden bei 37 °C. HINWEIS: Das Protokoll kann hier gestoppt werden, bis die Infektion 18 Stunden Inkubationszeit erreicht hat und die Platte bereit ist, mit dem Luciferase-Assay analysiert zu werden. Der Erfolg der Infektion wird durch den Luziferase-Assay bestimmt, der aus dem in den infizierten Zellen exprimierten Luciferase-Reportergen resultiert, daher ist die Infektion der Ha-CoV-2-Variante umso erfolgreicher, je mehr Signal erzeugt wird.</li>
	<li>Luciferase-Assay: Nach 18 Stunden Inkubation 7,5 μl Zelllysepuffer direkt in jede Vertiefung geben und 2 Minuten lang durch orbitales Schütteln mischen. Zellen in Lysepuffer für mindestens 5 min bei Raumtemperatur lysieren.</li>
	<li>Bereiten Sie die Firefly-Luciferase-Assay-Lösung vor, indem Sie die D-Luciferin-Lösung mit der Firefly-Luciferase-Assay-Lösung im Verhältnis 1:50 mischen. Kombinieren Sie für eine ganze 96-Well-Platte 3 ml der Luciferase-Substratlösung mit 60 μl der D-Luciferin-Lösung mit 2940 μl der Firefly-Luciferase-Pufferlösung.</li>
	<li>Geben Sie 25 μl der Firefly-Luciferase-Assay-Lösung zu den Zelllysaten und mischen Sie die Platte durch Orbitalschütteln für 1 Minute. Analysieren Sie die Luciferase-Aktivität mit einem handelsüblichen Luciferase-Mikroplatten-Reader.</li>
</ol>3. RNA-Extraktion von Ha-CoV-2 und quantitative Reverse-Transkriptase-PCR (RT-qPCR)
<ol><li>Extraktion viraler RNA: Extrahieren Sie die virale RNA aus Ha-CoV-2-Wildtyp- und Ha-CoV-2-Delta- und Omicron-Variantenpartikeln mit einem kommerziellen viralen RNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Lagern Sie die extrahierte virale RNA bei -80 °C oder verwenden Sie sie sofort für die RT-qPCR.</li>
	<li>RT-qPCR: Führen Sie die RT-qPCR an viraler RNA mit einem einstufigen Mastermix durch. Führen Sie die Reaktion in einem handelsüblichen PCR-Gerät durch. Bitte beachten Sie, dass das Ziel der Amplifikation die genomische RNA von Ha-CoV-2 ist. Verwenden Sie Ha-CoV-2-Vektor-DNA als Standard für die Erstellung einer Standardkurve und die Berechnung der RNA-Kopienzahl jeder Variante.</li>
</ol>4. Neutralisierender Antikörper-Assay
<ol><li>Aussaat HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen: Am Tag vor dem Assay HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen in einer 96-Well-Platte in 50 μl vollständigem DMEM-Medium säen. HEK293T (ACE2/TMPRSS2)-Zellen werden kommerziell gekauft.</li>
	<li>Zum Zählen der Zellen werden 20 μl-Zellen aus einem T75-Kolben mit HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen entnommen und mit 20 μl Trypanblaulösung gemischt. Geben Sie 20 μl dieser Mischung in die Zellzählkammer und zählen Sie die Anzahl der Zellen pro ml. Um eine 96-Well-Platte für die Infektion zu säen, verwenden Sie 2,5 x 104 Zellen pro Well, und insgesamt werden 2,5 x 106 Zellen benötigt. Die 96-Well-Platte über Nacht bei 37 °C in einen CO2 -Inkubator stellen.</li>
	<li>Neutralisierender Antikörper-Assay: Bereiten Sie in einer sterilen 96-Well-Platte aus Polypropylen die standardmäßige Mischung aus neutralisierendem 27BV-Antikörper und Ha-CoV-2 vor. Geben Sie 8 μl 27BV (45 mg/ml) in die Platte und führen Sie serielle Verdünnungen des Antikörpers mit 6 μl serumfreiem DMEM durch. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Pipettenspitzen zwischen den Well-Transfers auszutauschen und sicherzustellen, dass der Antikörper und das serumfreie Medium gründlich gemischt sind, um genaue Ergebnisse zu erzielen.</li>
	<li>Dem seriell verdünnten Antikörper werden 54 μl Ha-CoV-2-Partikel zugesetzt und das Virus und der Antikörper vermischt. Ha-CoV-2-Partikel mit seriell verdünntem 27BV 1 h bei 37 °C bei 5 % CO2 vorinkubieren. Nach der 1-stündigen Inkubation werden 50 μl des Antikörper-Ha-CoV-2-Gemisches auf die 96-Well-Platte mit den am Vortag ausgesäten HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen (2,5 x 104 Zellen pro Well) gegeben.</li>
	<li>Lassen Sie für Kontrollen mindestens drei Vertiefungen, die nur die HEK293T (ACE2/TMPRSS2)-Zellen enthalten. Geben Sie 50 μl vollständiges Medium in diese Vertiefungen, die als nicht infizierte Vertiefungen für das Hintergrundsignal der Luciferase-Assay-Messwerte dienen. HINWEIS: Das Protokoll kann hier gestoppt werden, bis die Infektion 18 Stunden Inkubationszeit bei 37 °C erreicht hat und die Platte dann für die Analyse mittels Luciferase-Assay bereit ist.</li>
	<li>Luciferase-Assay: Nach 18 Stunden Inkubation 7,5 μl Lysepuffer direkt in jede Vertiefung geben und 2 Minuten lang durch orbitales Schütteln mischen. Zellen in Lysepuffer für mindestens 5 min bei Raumtemperatur lysieren.</li>
	<li>Bereiten Sie die Firefly-Luciferase-Assay-Lösung vor, indem Sie die D-Luciferin-Lösung mit der Firefly-Luciferase-Assay-Lösung im Verhältnis 1:50 mischen. Kombinieren Sie für eine ganze 96-Well-Platte 3 ml der Luciferase-Substratlösung mit 60 μl der D-Luciferin-Lösung mit 2940 μl der Glühwürmchen-Luciferase-Pufferlösung.</li>
	<li>Geben Sie 25 μl der Firefly-Luciferase-Assay-Lösung zu den Zelllysaten und mischen Sie die Platte durch Orbitalschütteln für 1 Minute. Analysieren Sie die Luciferase-Aktivität mit einem handelsüblichen Luciferase-Mikroplatten-Reader.</li>
</ol>5. Quantifizierung und statistische Analyse
<ol><li>Datenerhebung: Führen Sie Infektions- und Luciferase-Assays in dreifacher Ausführung durch, wie angegeben (Abbildung 1). Quantifizieren Sie die Luciferase-Expression mit Luciferase-Assay-Messwerten. Der Mittelwert ist der Durchschnittswert der drei Luciferase-Assay-Messwerte. Hintergrundsignalwerte aus nicht infizierten Vertiefungen werden von diesem Mittelwert abgezogen. Die Standardabweichung (SD) wird aus dem Durchschnittswert der Luciferase-Assay-Messwerte bestimmt.</li>
	<li>Datenanalyse: Zeichnen Sie die Antikörperneutralisationsaktivität auf und berechnen Sie die ID50-Werte (50% Hemmdosis) mit kommerzieller Grafiksoftware. DerID-50-Wert ist definiert als die Antikörper-inhibitorischen Verdünnungen, bei denen eine 50%ige Verringerung der Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen (basierend auf Luciferase-Assay-Messwerten) erreicht wird.</li>
</ol>

Quantifizierung von impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern in SARS-CoV-2-Varianten

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Weekly epidemiological update on COVID-19. 143, 1 (2023).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+emerging+Omicron+variant+of+SARS-CoV-2:+Impacts,+challenges+and+strategies.">Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies.</a> Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronavirus+Disease+2019-COVID-19.">Coronavirus Disease 2019-COVID-19.</a> Clinical Microbiology Reviews. 33 (4), e00028-e00020 (2020).</li><li>El-Shabasy, R. 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Ein Patent wurde von der George Mason University angemeldet und an Virongy Biosciences Inc. für die Produktentwicklung lizenziert. Y.W. ist Gründer und Mitglied des Beirats von Virongy Biosciences. B. H. ist derzeit CEO und Chief Scientific Officer von Virongy Biosciences. Die Autoren haben keine anderen Interessenkonflikte.

Die Ha-CoV-2-Plattform bietet einen schnellen, robusten und einfachen Arbeitsablauf zur Quantifizierung von Virusvarianten und zur Neutralisierung von Antikörpern. Es gibt jedoch einige kritische Schritte, die beachtet werden müssen. Die Herstellung des Ha-CoV-2-Pseudovirus sollte mit HEK293T Zellen mit hoher Lebensfähigkeit erfolgen. Die Kotransfektionseffizienz kann 24 Stunden nach der Transfektion mit dem GFP-Reportergen aus dem Ha-CoV-2-Genom überwacht werden. Das Ha-CoV-2-Genom kann zwei Reporter (GFP und Luc) enthalten, und GFP kann während der Kotransfektion und nach einer Ha-CoV-2-Infektion von Zielzellen exprimiert werden12. Die GFP+-Zellen aus der Infektion haben normalerweise einen geringen Prozentsatz (1% bis 5%), aber jede infizierte Zelle exprimiert starke GFP-Signale (Abbildung 3). Dieser niedrige GFP-Prozentsatz könnte die Verwendung von GFP als robustes Messwert zur Quantifizierung der Antikörperneutralisation im Vergleich zum Luc-Reporter, der die gesamte Population infizierter Zellen quantifiziert, einschränken.
Bei der Durchführung des Neutralisationsassays ist es wichtig, die Pipettenspitzen zwischen den Well-Transfers zu wechseln und sicherzustellen, dass der Antikörper und das serumfreie Medium gründlich gemischt werden, um genaue Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus müssen die Zellen bei der Durchführung des Luciferase-Assay-Protokolls mindestens 3 Minuten lang vollständig lysiert werden, um eine vollständige Lyse der Zellen und die Freisetzung des Luciferase-Enzyms zu gewährleisten. Dadurch wird die Genauigkeit des Assays sichergestellt. Sobald die Firefly-Luciferase-Assay-Lösung zu den optischen weißwandigen 96-Well-Platten hinzugefügt wurde, muss die Platte innerhalb von 10 Minuten analysiert werden, da die anfängliche Lichtemission hoch ist, aber mit der Zeit abnimmt, wenn das ATP erschöpft ist21.
Da sich immer mehr SARS-CoV-2-Varianten weiterentwickeln, besteht ein erhöhter Bedarf an Plattformen wie Ha-CoV-2, um schnell auf die Infektiosität von Varianten und die Empfindlichkeit von Varianten gegenüber impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern zu untersuchen. Die Ha-CoV-2-Plattform bietet eine höhere Geschwindigkeit, ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis und ein einfaches Protokoll im Vergleich zu bestehenden pseudovirusbasierten Neutralisationsassays 8,9,10,11. Die Ha-CoV-2-Plattform bietet zudem den Vorteil, dass sie in BSL-2-Laboren eingesetzt werden kann und keine BSL-3-Einrichtungen benötigt. Dadurch kann SARS-CoV-2 in gemeinsamen Forschungs- und klinischen Labors erforscht werden. Darüber hinaus liefert die Ha-CoV-2-Plattform im Vergleich zu anderen Systemen schnelle Ergebnisse. Beispielsweise wird bei der Untersuchung neutralisierender Antikörper gegen das infektiöse SARS-CoV-2-Virus häufig der Plaque-Reduktions-Neutralisationstest (PRINT) verwendet22. Obwohl PRINT zuverlässige Ergebnisse liefert, ist die manuelle Zählung von plaquebildenden Einheiten (PFUs) langsam und benötigt 3-5 Tage, um Ergebnisse zu erhalten 23,24. Andere Pseudotypsysteme, wie z.B. das Lentivirus-Pseudovirus, benötigen 24-72 h, um ein nachweisbares Reportersignalzu erzeugen 12. Im Vergleich dazu kann der Ha-CoV-2-Neutralisationsassay innerhalb von 18 h Ergebnisse liefern. Das Ha-CoV-2 bietet ein praktisches Werkzeug für das schnelle Screening und die Quantifizierung von Virusvarianten und neutralisierenden Antikörpern für die Pandemieüberwachung.
Die Überwachung der Infektiosität von SARS-CoV-2 ist von entscheidender Bedeutung, da immer mehr besorgniserregende Varianten (VOCs) auftauchen. Ha-CoV-2 bietet den Vorteil, dass die Infektiosität von VOCs schnell bestimmt werden kann. Frühere Studien haben auf künstlicher Intelligenz (KI) basierende Modellierung verwendet, um die Infektiosität der Omikron-Subvariante und der anderen SARS-CoV-2-Varianten, wie z. B. der Delta-Variante25, quantitativ zu analysieren. Diese Studien haben gezeigt, dass die Omicron-Variante ansteckender ist als das ursprüngliche Virus und mit größerer Wahrscheinlichkeit neutralisierenden Antikörpern entgeht25. In diesen Studien wurden mit Ha-CoV-2 ähnliche Phänotypen beobachtet. Darüber hinaus ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Omicron-Variante in den Antikörper-Neutralisations-Assays von 27BV neutralisiert wird, zehnmal geringer als bei den Stämmen Wuhan und Delta. Diese Ergebnisse stehen auch im Einklang mit der berichteten höheren Übertragbarkeit der Omikron-Variante, die mindestens 15 Mutationen auf ihrer Rezeptorbindungsdomäne (RBD) aufweist, was wahrscheinlich die virale Bindungsaffinität zum ACE2-Rezeptor für eine höhere Übertragbarkeit und eine größere Immunflucht erhöht26.

Im Mai 2023 gab es nun mehr als 766 Millionen COVID-19-Fälle1. Trotz weltweiter Impfkampagnen zirkuliert SARS-CoV-2 kontinuierlich und infiziert Menschen, was vor allem auf das Auftreten neuer Varianten wie Delta (B.1.617.2) und Omikron (B.1.1.529) zurückzuführen ist, die neue Infektionswellen auslösen 2,3,4. Da sich SARS-CoV-2 ständig weiterentwickelt, ist es wichtig, schnelle Assays zu entwickeln, die die Infektiosität neu auftretender Varianten und die Wirksamkeit von impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern gegen diese Varianten genau messen können. Diese Assays sind für die Pandemieüberwachung und für die Bestimmung der Wirksamkeit von Impfstoffen und ihren variantenspezifischen Auffrischungsimpfungen unerlässlich.
Aufgrund der hochansteckenden Natur von SARS-CoV-2 verlangt das Center for Disease Control and Prevention (CDC), dass die Untersuchung von SARS-CoV-2 und seinen Varianten in Einrichtungen der Biosicherheitsstufe (BSL) 3 durchgeführt wird 5,6. Diese BSL-3-Anforderung schränkt die Verwendung lebender Viren zur Quantifizierung der Infektiosität von Virusvarianten und ihrer neutralisierenden Antikörper in gemeinsamen Forschungs- und klinischen Labors ein. Darüber hinaus sind herkömmliche SARS-CoV-2-Neutralisationsassays, wie z. B. die auf Plaques oder zytopathischer Wirkung basierenden Assays mit replikationskompetenten Lebendviren, zeitaufwändig und erfordern lange Inkubationszeiten7. Mehrere Spike-Protein-pseudotypisierte SARS-CoV-2-Pseudoviren wurden entwickelt, um die Wirksamkeit neutralisierender Antikörperzu quantifizieren 8,9,10,11,12. Bei SARS-CoV-2 ist das S-Protein das Hauptprotein, das den Viruseintritt vermittelt13 und das Hauptantigen, das in SARS-CoV-2-Impfstoffenverwendet wird 9,10,14,15,16. Die S-Protein-pseudotypisierten Virionen, wie die des vesikulären Stomatitisvirus (VSV-G) oder des Lentivirus, wurden zur Quantifizierung neutralisierender Antikörper verwendet 17,18,19. Dennoch benötigt das Lentivirus-basierte Pseudovirus normalerweise 2 bis 3 Tage der Infektion, um Reportersignale zu quantifizieren. VSV-basierte Pseudovirussysteme enthalten häufig VSV-Restviren, die zu hohen Raten falsch-positiver Ergebnisse führen können und typischerweise 24 Stunden Infektion erfordern20.
Ein neuartiges SARS-CoV-2-Pseudovirussystem, das hybride Alphavirus-SARS-CoV-2-Pseudovirus (Ha-CoV-2), wurde kürzlich von Hetrick et al.12 entwickelt. Ha-CoV-2 bietet ein neues Werkzeug zur schnellen Quantifizierung der Virusinfektiösität und der Virusempfindlichkeit gegenüber neutralisierenden Antikörpern in gängigen BSL-2-Labors. Strukturell ähnelt Ha-CoV-2 dem SARS-CoV-2-Virionpartikel, das aus SARS-CoV-2-Strukturproteinen besteht, einschließlich des S-Proteins (S), der Membran (M), des Nukleokapsids (N) und der Hülle (E), und es gibt kein Strukturprotein von anderen Viren. Darüber hinaus enthält das Ha-CoV-2-Partikel ein schnell exprimierendes RNA-Genom aus einem Alphavirus für eine schnelle Reporterexpression in Zellen. Es wurde gezeigt, dass Ha-CoV-2 die neutralisierende Aktivität von Antikörpern in den Seren von geimpften und genesenen Personen schnell misst12. Wie Hetrick et al. zeigten, exprimierte Ha-CoV-2 im Vergleich zu einem Lentivirus-basierten SARS-CoV-2-Pseudovirus in einem Zeitverlaufsassay den Luc-Reporter bereits 2-4 h nach der Infektion, während das Lentivirus-Pseudovirus Luc nach 24 hexprimierte. Darüber hinaus wird die potenzielle Anwendung von Ha-CoV-2-Varianten zur Quantifizierung neutralisierender Antikörper durch die Verwendung eines monoklonalen neutralisierenden Standardantikörpers, 27BV, weiter demonstriert (siehe ergänzende Abbildung 1)12. In dieser Arbeit wird die Verwendung der Ha-CoV-2-Plattform zur schnellen Quantifizierung der Infektiosität von SARS-CoV-2-Varianten am Beispiel der Varianten Delta (B.1.617.2) und Omikron (B.1.1.529) beschrieben. Darüber hinaus wird die potenzielle Anwendung von Ha-CoV-2-Varianten zur Quantifizierung neutralisierender Antikörper durch die Verwendung eines monoklonalen neutralisierenden Standardantikörpers, 27BV12, weiter demonstriert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>27VB1 20 &#181;g SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>27VBI-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL - US Origin FBS</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>Cat# 24-300&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>2043-30-1158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit</td>
			<td>Genesee Scientfic</td>
			<td>25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlowMax Discover Microplate reader</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>GM3000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 E Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 M Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 N Vector&#160;</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ha-CoV-2 WT S Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2_WT S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hek293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays</td>
			<td>Gold Bio&#160;</td>
			<td>I-930-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, &#956;Clear White Flat Round, Chimney)&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>Cat# 82050-758&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAlphaPro-Luc-GFP-Pre&#936; (Ha-CoV-2 Genome) Vector&#160;</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-based Transfection Reagent</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>Transfectin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>408727-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>A43163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>Ready-To-Use-Cells</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 S&#160; Omicron (B.1.1.529) Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2-B.1.1.529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2)&#160;Vector</td>
			<td>Virongy Biosciences</td>
			<td>pCoV2- B.1.617.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PES, 0.22&#181;m</td>
			<td>Genesee Scientfic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>4444432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of ha-cov-2 pseudovirus for rapid quantification of sars-cov-2 variants and neutralizing antibodies

Die Coronavirus-Pandemie 2019 (COVID-19) hat die Notwendigkeit von Schnelltests zur genauen Messung der Infektiosität neu auftretender SARS-CoV-2-Varianten und der Wirksamkeit von impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern gegen Virusvarianten deutlich gemacht. Diese Assays sind für die Pandemieüberwachung und die Validierung von Impfstoffen und variantenspezifischen Auffrischungsimpfungen unerlässlich. Dieses Manuskript demonstriert die Anwendung eines neuartigen hybriden Alphavirus-SARS-CoV-2-Pseudovirus (Ha-CoV-2) zur schnellen Quantifizierung der Infektiosität von SARS-CoV-2-Varianten und impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern gegen Virusvarianten. Ha-CoV-2 ist ein SARS-CoV-2-Virus-ähnliches Partikel, das aus viralen Strukturproteinen (S, M, N und E) und einem schnell exprimierenden RNA-Genom besteht, das von einem Alphavirus, dem Semliki-Waldvirus (SFV), abgeleitet ist. Ha-CoV-2 enthält auch sowohl grün fluoreszierendes Protein (GFP) als auch Luciferase-Reportergene, die eine schnelle Quantifizierung der viralen Infektiosität ermöglichen. So wird beispielsweise die Infektiosität der Varianten SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) und Omikron (B.1.1.529) quantifiziert und ihre Empfindlichkeit gegenüber einem neutralisierenden Antikörper (27VB) gemessen. Diese Beispiele zeigen das große Potenzial von Ha-CoV-2 als robuste Plattform für die schnelle Quantifizierung von SARS-CoV-2-Varianten und deren Anfälligkeit für neutralisierende Antikörper.

As of May 2023, there have now been more than 766 million COVID-19 cases1. Despite worldwide vaccination campaigns, SARS-CoV-2 continuously circulates and infects people, largely due to the emergence of new variants such as Delta (B.1.617.2) and Omicron (B.1.1.529) that drive new waves of infection2,3,4. Given that SARS-CoV-2 is constantly evolving, it is important to develop quick assays that can accurately measure the infectivity of emerging variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against these variants. These assays are essential for pandemic surveillance and for determining the efficacy of vaccines and their variant-specific boosters.
Due to the highly contagious nature of SARS-CoV-2, the Center for Disease Control and Prevention (CDC) requires that the study of SARS-CoV-2 and its variants is conducted in biosafety level (BSL) 3 facilities5,6. This BSL-3 requirement limits the use of live viruses for quantifying the infectivity of viral variants and their neutralizing antibodies in common research and clinical laboratories. In addition, traditional SARS-CoV-2 neutralization assays, such as the plaque- or cytopathic effect-based assays using replication-competent live viruses, are time-consuming and require long incubation periods7. Several spike (S) protein-pseudotyped SARS-CoV-2 pseudoviruses have been developed to quantify the effectiveness of neutralizing antibodies8,9,10,11,12. In SARS-CoV-2, the S protein is the major protein that mediates viral entry13, and is the main antigen used in SARS-CoV-2 vaccines9,10,14,15,16. The S protein-pseudotyped virions, such as those of the vesicular stomatitis virus (VSV-G) or lentivirus, have been used for the quantification of neutralizing antibodies17,18,19. Nevertheless, the lentivirus-based pseudovirus normally requires 2 to 3 days of infection in order to quantify reporter signals. VSV-based pseudovirus systems often contain residual VSV viruses, which can result in high rates of false-positive results and typically require 24 h of infection20.
A novel SARS-CoV-2 pseudovirus system, the hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2), has been recently developed by Hetrick et al12. Ha-CoV-2 provides a new tool for the rapid quantification of virus infectivity and virus sensitivity to neutralizing antibodies in common BSL-2 laboratories. Structurally, Ha-CoV-2 resembles the SARS-CoV-2 virion particle, consisting of SARS-CoV-2 structural proteins including the S protein (S), the membrane (M), the nucleocapsid (N), and the envelope (E), and there is no structural protein from other viruses. Additionally, Ha-CoV-2 particle contains a rapid-expressing RNA genome from an alphavirus for fast reporter expression in cells. Ha- CoV-2 has been shown to quickly measure the neutralizing activity of antibodies in the sera of vaccinated and convalescent individuals12. As demonstrated by Hetrick et al., when compared with lentivirus-based SARS-CoV-2 pseudovirus in a time course assay, Ha-CoV-2 expressed the Luc reporter as early as 2-4 h post-infection while the lentivirus-pseudovirus expressed Luc after 24 h12. In addition, the potential application of Ha-CoV-2 variants for quantifying neutralizing antibodies is further demonstrated by using a&#160; standard monoclonal neutralizing antibody, 27BV (See Supplementary Figure 1)12. This work details the use of the Ha-CoV-2 platform for rapid quantification of the infectivity of SARS-CoV-2 variants, using the Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants as examples. In addition, the potential application of Ha-CoV-2 variants for quantifying neutralizing antibodies is further demonstrated by using a standard monoclonal neutralizing antibody, 27BV12.

Autor im Rampenlicht: Ein Pseudotyp-Virussystem zur Bewertung von Omikron-Subvarianten und zur Neutralisierung von Antikörpern in der SARS-CoV-2-Forschung

Anwendung des Ha-CoV-2-Pseudovirus zur schnellen Quantifizierung von SARS-CoV-2-Varianten und neutralisierenden Antikörpern

We have established two main findings in this protocol. First, our Ha-CoV-2 platform demonstrates that the newly emerged Omicron subvariant is more infectious than the original Wuhan strain. Additionally, Omicron subvariants are more resistant to neutralizing antibodies induced by previous strains.SARS CoV-2 research requires BSL-3 facilities, making it difficult for common laboratories to monitor SARS-CoV-2 variants and to quantify neutralizing antibodies. Our Ha-CoV-2 system is a pseudotype virus that can be used in common laboratories and provides a faster way to quantify viral variants and their sensitivity to neutralizing antibodies. Ha-CoV-2 is a virus-like particle that has all the structural proteins of SARS-CoV-2 and resembles SARS-CoV-2.Also, Ha-CoV-2 uses and alpha viral vector for robust and rapid gene expression, producing fast results and a high signal to noise ratio for great reproducibility.

Ha-CoV-2-Partikel wurden mit fünf verschiedenen DNA-Vektoren zusammengesetzt, die das Ha-CoV-2-RNA-Genom und die Strukturproteine (M, N, E und S) von SARS-CoV-2 in HEK293T Zellen exprimieren. Der S-Protein-Vektor variiert je nach S-Variante. Das S-Protein aus dem ursprünglichen Ha-CoV-2-Wuhan-Stamm (Wildtyp, Wt) wurde als Positivkontrolle verwendet und zusammen mit dem S-Protein aus jeder der beiden anderen Varianten zusammengesetzt: Delta (B.1.617.2) oder Omikron (B.1.1.529). In allen Varianten wurden die gleichen M, N, E verwendet. Ha-CoV-2(Wt)- und Variantenpartikel wurden 48 Stunden nach der Kotransfektion gesammelt und dann zur Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen verwendet. Die Infektiosität wurde durch die Expression von Luciferase 18 h nach der Infektion gemessen. In diesem System spiegeln höhere Expressionsniveaus des Luciferase-Signals eine höhere Infektion der Zellen mit Ha-CoV-2 wider. Das Luciferase-Signal wurde mit genomischen RNA-Kopien durch RT-qPCR für jede Variante normalisiert. Wie in Abbildung 1 gezeigt, erzeugte die Ha-CoV-2-Omikron-Variante ein 4- bis 10-fach höheres Signal als die ursprüngliche Ha-CoV-2(Wt), was auf eine höhere Infektiosität hindeutet.
Darüber hinaus wurde die Fähigkeit von 27BV zur Neutralisierung von HaCoV-2(Wt), Delta- und Omicron-Varianten quantifiziert. 27BV ist ein monoklonaler Kaninchen-Antikörper, der gegen die RBD-Domäne des SARS-COV-2 S1-Proteins entwickelt wurde. Für Neutralisationsassays wurden serielle Verdünnungen von 27BV in einer 96-Well-Platte durchgeführt, mit Ha-CoV-2 vorinkubiert und dann zu HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zielzellen hinzugefügt. Die Ergebnisse zeigten, dass 27BV eine neutralisierende Aktivität gegen alle getesteten Varianten aufwies (Abbildung 2). Interessanterweise war der ID50 von 27VB für Omicron etwa 10-mal weniger wirksam als der ID50 für Ha-CoV-2(WT) und Ha-CoV-2(Delta; Abbildung 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Ha-COV-2-Plattform als schnelle Methode zur Quantifizierung von impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern in neu auftretenden Varianten eingesetzt werden kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig01.jpg"> Abbildung 1. Assemblierung und Quantifizierung von Ha-CoV-2-Varianten. (A) Illustration der Assemblierung des Ha-CoV-2 und der Variantenpartikel. Die Vektoren, die das Ha-CoV-2-Reportergenom und die Strukturproteine (M, S, N und E) exprimieren, werden in HEK293T Zellen kotransfiziert. Die Partikel wurden 48 Stunden nach der Kotransfektion geerntet (die Bildgebung von Virionpartikeln und HEK293T Zellen wurde mit Biorender.com erstellt). (B) Quantifizierung der Infektiosität von Ha-CoV-2-Varianten. Die relative Infektiosität der beiden Varianten (Delta und Omicron) wird anhand genomischer RNA-Kopien einzelner Ha-CoV-2 (Luc)-Varianten quantifiziert und normalisiert. Wildtyp ist der Ha-COV-2 (Wt), der als Kontrolle zum Vergleich verwendet wird. Infektions- und Luciferase-Assays wurden 3x durchgeführt. RU, relative Einheit. Der Mittelwert und die Standardabweichung (SD) werden angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig02.jpg"> Abbildung 2. Quantifizierung der 27BV-Neutralisationsaktivität gegen Ha-CoV-2(Luc)-Varianten Die Neutralisationsaktivität von 27BV wurde 18 h nach der Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen analysiert. Die ID50 wurde anhand der relativen Infektionsrate (Luciferase-Aktivität) im Vergleich zur 27BV-Konzentration berechnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65793/65793fig03.jpg"> Abbildung 3. Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2) mit Ha-CoV-2(GFP). Ha-CoV-2(GFP)-Partikel wurden zusammengesetzt und dann verwendet, um HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen zu infizieren. Die GFP-Expression wurde 48 Stunden nach der Infektion mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Das weiße Feld infizierter Zellen ist links und die GFP-Bildgebung rechts dargestellt. Der weiße Balken steht für 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/65793fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1. Grafische Zusammenfassung. Die Struktur und Anwendung des Ha-CoV-2-Pseudovirus. Mit Biorender.com erstelltes Bild. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Graphical%20Abstract_RE.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Akte 1. Proteinsequenzen. Liste der Sequenzen der SARS-CoV-2 S-, M-, N- und E-Proteine. Zu den S-Protein-Sequenzen gehören auch die SARS-CoV-2-Varianten Omikron (B.1.1.529) und Delta (B.1.617.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65793/Protein%20Sequences_joVE_RE.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies at JoVE.com

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung eines neuartigen hybriden Alphavirus-SARS-CoV-2-Pseudovirus (Ha-CoV-2) als Plattform für die schnelle Quantifizierung der Infektiosität von SARS-CoV-2-Varianten und ihrer Empfindlichkeit gegenüber neutralisierenden Antikörpern.

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Wir haben zwei Hauptergebnisse in diesem Protokoll festgelegt. Erstens zeigt unsere Ha-CoV-2-Plattform, dass die neu aufgetretene Omikron-Subvariante infektiöser ist als der ursprüngliche Wuhan-Stamm. Darüber hinaus sind Omikron-Subvarianten resistenter gegen neutralisierende Antikörper, die durch frühere Stämme induziert wurden.Die SARS-CoV-2-Forschung erfordert BSL-3-Einrichtungen, was es für gängige Labore schwierig macht, SARS-CoV-2-Varianten zu überwachen und neutralisierende Antikörper zu quantifizieren. Unser Ha-CoV-2-System ist ein Pseudotyp-Virus, das in gängigen Labors eingesetzt werden kann und eine schnellere Möglichkeit bietet, Virusvarianten und ihre Empfindlichkeit gegenüber neutralisierenden Antikörpern zu quantifizieren. Ha-CoV-2 ist ein virusähnliches Partikel, das alle Strukturproteine von SARS-CoV-2 enthält und SARS-CoV-2 ähnelt.Außerdem verwendet Ha-CoV-2 einen alphaviralen Vektor für eine robuste und schnelle Genexpression, der schnelle Ergebnisse und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis für eine hervorragende Reproduzierbarkeit liefert.

application-ha-cov-2-pseudovirus-for-rapid-quantification-sars-cov-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

711 Aufrufe.  George Mason University. Wir haben zwei Hauptergebnisse in diesem Protokoll festgelegt. Erstens zeigt unsere Ha-CoV-2-Plattform, dass die neu aufgetretene Omikron-Subvariante infektiöser ist als der ursprüngliche Wuhan-Stamm. Darüber hinaus sind Omikron-Subvarianten resistenter gegen neutralisierende Antikörper, die durch frühere Stämme induziert wurden.Die SARS-CoV-2-Forschung erfordert BSL-3-Einrichtungen, was es für gängige Labore schwierig macht, SARS-CoV-2-Varianten zu überwachen und neutralisier...

Serie: Autor im Rampenlicht: Ein Pseudotyp-Virussystem zur Bewertung von Omikron-Subvarianten und zur Neutralisierung von Antikörpern in der SARS-CoV-2-Forschung

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

Forschung

Immunologie und Infektion

Assembling Ha-CoV-2 Particles by Cotransfection of HEK293T Cells for Quantification of SARS-CoV-2 Variants

Begin by maintaining HEK293T cells and DMEM containing heat inactivated FBS, Penicillin, and Streptomycin in a T75 flask. For cell counting, mix 20 microliters of cell suspension with 20 microliters of trypan blue solution. Add 20 microliters of dye-mixed cell suspension to the cell counting chamber and count the number of cells per milliliter.Seed HEK293T cells and 10 milliliters of complete DMEM in a 10 centimeter cell culture Petri dish. Incubate the cells overnight in a carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius. The next day, remove the complete medium and replace it with nine milliliters of DMEM serum-free medium.Using the given compounds of viral particle assembly, prepare a cotransfection mixture. Slowly add the mixture to the Petri dish, and incubate at 37 degrees Celsius for six hours. After incubation, replace the serum-free DMEM with a complete DMEM medium and continue incubation for cotransfection for up to 48 hours.Then detach the cells by repeatedly pipetting over the surface of the monolayer and transfer the suspension into a 15 milliliter tube. Centrifuge the cell suspension at 400G for five minutes. Collect the supernatant and pass it through a 0.22 micron filter.Store the filtrate containing Ha-CoV-2 pseudovirus at 80 degrees Celsius.

Assemblierung von Ha-CoV-2-Partikeln durch Kotransfektion von HEK293T Zellen zur Quantifizierung von SARS-CoV-2-Varianten

Quantification of Ha-CoV-2 Variants and 27BV Neutralization Activity Against Ha-CoV-2(Luc) Variants

Begin by maintaining HEK-293T ACE2 TMPRSS2 cells in DMEM containing heated activated FBS, penicillin, and streptomycin in a T75 flask. For cell counting, mix 20 microliters of cell suspension with 20 microliters of Trypan Blue solution. Add 20 microliters of dye-mixed cell suspension to the cell counting chamber, and count the number of cells per milliliter.Seed 2.5 times 10 to the power of four HEK-293T ACE2 TMPRSS2 cells in 50 microliters of complete DMEM medium into each well of a 96-well plate. Incubate the cells in a carbon dioxide incubator overnight at 37 degrees Celsius. The next day, replace the 50 microliters of DMEM with 50 microliters of virus suspension, and incubate for 18 hours at 37 degrees Celsius.After incubation, add 7.5 microliters of cell lysis buffer to each well, and mix on an orbital shaker for two minutes. Once the cells are lysed, add freshly prepared firefly luciferase assay solution, and mix them on an orbital shaker for one minute. Analyze the luciferase activity by using a commercial luciferase microplate reader.For neutralizing antibody assay, seed HEK-293T cells in 50 microliters of complete DMEM as demonstrated previously. In a 96-well plate, add eight microliters of 27 BV neutralizing antibody, and perform serial dilutions with six microliters of serum-free DMEM. Add 54 microliters of Ha-CoV-2 virus particle to the serially diluted antibody, and mix the suspension.Incubate for one hour at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide. Then add 50 microliters of virus suspension to the wells containing HEK-293T cells. For controls, add 50 microliters of complete DMEM medium into the wells containing only HEK-293T cells.Place the plate in an incubator at 37 degrees Celsius for 18 hours. After lysing the cells as demonstrated previously, add freshly prepared firefly luciferase assay solution, and mix by orbital shaking for one minute. Analyze the luciferase activity by using a commercial luciferase microplate reader.Ha-CoV-2 Omicron and Omicron variants generated four to tenfold higher signal than the Wild-type Ha-CoV-2, suggesting higher infectivity. The antibody 27 BV demonstrated neutralizing activity against both Delta and Omicron variants. The ID50 of 27 BV for Omicron was approximately 10 times less potent than the ID50 for Wild-type and Delta.