Unseres Wissens ist dies das erste Beispiel für ein perlenbasiertes Multiplexing-Protokoll, das zwei Reportersignale verwendet, um gleichzeitig zwei Ergebnisse pro Analyt zu messen. Diese Technik ermöglicht es dem Benutzer, antigenspezifisches IgM und IgG gleichzeitig zu messen, mit weniger Probe und einer kürzeren Zeit bis zu den Ergebnissen. Während diese Dual-Reporter-Methode spezifisch für die Antikörper-Isotypisierung ist, könnte sie angepasst werden, um andere Analytpaare zu messen, wie post-translationale Modifikationen oder freie versus gebundene Wirkstoffformen.
Dr. Steve Angeloni, ein leitender Feldanwendungswissenschaftler der Luminex Corporation, demonstriert heute unser Verfahren. Um mit dem dualen IgG- und IgM-serologischen Assay zu beginnen, bereiten Sie die erforderlichen Multiplex-Perlenmischungen aus den einzelnen Paarperlen vor und kontrollieren Sie die Perlenbestände in einer Konzentration von einmal 10 bis zu den sechs Perlen pro Milliliter. Als nächstes verdünnen Sie die Serumproben 100-fach, indem Sie 10 Mikroliter Serum zu 990 Mikroliter PBS-TBN-Puffer hinzufügen, und verdünnen Sie die Proben dann um das Zehnfache, indem Sie 20 Mikroliter der 1:100-Verdünnung auf 180 Mikroliter PBS-TBN hinzufügen.
Wenn die Perlenmischungen und Serumproben fertig sind, fügen Sie 50 Mikroliter der Multiplexperlenmischungen zu den zugewiesenen Vertiefungen einer 96-Well-unverbindlichen Mikrotiterplatte hinzu und fügen Sie dann 50 Mikroliter der verdünnten Serumproben zu den entsprechenden Vertiefungen hinzu. Sobald alle Proben hinzugefügt wurden, decken Sie die Platte mit einer Mikroplattenfoliendichtung ab und inkubieren Sie sie auf einem beheizten Plattenschüttler bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Trennen Sie dann die Perlen vom Reaktionsgemisch, indem Sie die Platte für zwei Minuten auf einen Magnetplattenabscheider legen.
Halten Sie die Platte auf dem Magneten, entfernen Sie die Foliendichtung. Dann kehren Sie die Platte vorsichtig über einen Abfallbehälter um und streichen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen. Während Sie die Platte noch auf dem Magneten halten, flecken Sie die Platte auf saugfähigem Papier.
Um die Reaktionsschnüchte zu waschen, entfernen Sie die Platte vom Plattenmagneten und fügen Sie 150 Mikroliter PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu. Decken Sie die Platte mit einer frischen Foliendichtung ab und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang auf dem beheizten Shaker, bevor Sie sie für weitere zwei Minuten wieder auf den Plattenmagneten legen. Während Sie die Platte auf dem Magneten halten, kehren Sie die Platte um, um den Überstand zu verwerfen, und flecken Sie die Platte auf saugfähigem Papier.
Nach der zweiten PBS-TBN-Wäsche entfernen Sie die Platte vom Magneten und fügen Sie 100 Mikroliter frische Erkennungsreagenzmischung zu jeder Vertiefung hinzu. Nachdem Sie die Platte mit einer Mikroplattenfoliendichtung abgedeckt haben, legen Sie sie für 15 Minuten auf einen beheizten Plattenschüttler und dann für zwei Minuten auf einen Magnetplattenabscheider. Während sich die Platte auf dem Magneten befindet, entsorgen Sie die Erkennungsreagenzmischung, indem Sie die Platte über einen Abfallbehälter invertieren und auf saugfähigem Papier abträgen.
Waschen Sie die Reaktionsschüchte mit PBS-TBN zweimal, wie zuvor gezeigt, und entfernen Sie dann die Platte vom Magneten. Fügen Sie 100 Mikroliter PBS-TBN zu jeder Vertiefung hinzu, bedecken Sie dann die Platte mit Foliendichtung und schütteln Sie sie zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie die Foliendichtung und lesen Sie 50 Mikroliter der Probe aus jeder Vertiefung im Durchflussanalysator.
Um die Platte zu lesen, wählen Sie das Dropdown-Menü in der oberen linken Ecke, navigieren Sie zu Plattenkonfiguration, laden Sie die zuvor konfigurierte Platte und wählen Sie Platte ausführen aus. Werfen Sie den Plattenträger aus, indem Sie das Symbol Auswerfen auswählen, laden Sie die Platte dann auf den Plattenträger und wählen Sie das Symbol Zurückziehen, um den Plattenträger zurückzuziehen. Sobald sich der Plattenträger in den Analysator hineingezogen hat, wählen Sie das Symbol Ausführen, um mit dem Lesen der Platte zu beginnen.
Für den Dual-Reporter-Neutralisationstest fügen Sie 50 Mikroliter der Multiplex-Perlenmischungen zu zugewiesenen Vertiefungen einer 96-Well-nicht bindenden Mikrotiterplatte hinzu, fügen Sie dann 25 Mikroliter von zwei Mikrogramm pro Milliliter ACE2 zu jeder Vertiefung hinzu und beschichten Sie die Platte mit einer Foliendichtung. Nach einer zweiminütigen Inkubation auf einem beheizten Plattenschüttler werden 25 Mikroliter 1:500 Serumverdünnungen zu den zugewiesenen Vertiefungen hinzugefügt. Sobald alle Proben hinzugefügt wurden, führen Sie die Inkubations-, Wasch-, Detektions- und Analyseschritte durch, wie zuvor für den serologischen Assay gezeigt.
Ein Test von Anti-IgM, der mit dem DyLight 405-Reporterfarbstoff unter Verwendung von Serumproben innerhalb von fünf bis 60 Tagen nach Symptombeginn konjugiert wurde, und eine IgG-Streifen-Serumprobe erzeugten kein hohes Signal für das Spike-Antigen. Für Proben mit einer hohen mittleren IgM-Fluoreszenzintensität wurden die höchsten Signale für die Rezeptorbindungsdomäne und Nukleokapsidantigene beobachtet. Während der IgM-Titer in einigen Proben erhöht sein sollte, überstieg die beobachtete mittlere Fluoreszenzintensität 140 MFI-Einheiten nicht.
Darüber hinaus fehlte der Kontrollperle für IgM ein signifikanter Dynamikbereich für die mediane Fluoreszenzintensität, wenn DyLight 405 verwendet wurde, das mit Anti-IgM konjugiert war, verglichen mit einem Phycoerythrin-markierten Anti-IgM in der gleichen Konzentration. Für den IgG-Nachweis hatte das brillante Violettkonjugat Signale mit höherer medianer Fluoreszenzintensität als das Streptavidin-Konjugat von Fluorphor Super Bright 436. Die Signalintensität für das brillante violette Konjugat variierte jedoch über die ACE2-Titrationen hinweg.
Diese Signalfluktuation durch das brillantviolette Konjugat über ACE2-Konzentrationen hinweg störte auch die Bestimmung der prozentualen Hemmung durch ACE2 im Bereich der IgG-Titer. Für den IgM-Nachweis zeigte das Phycoerythrin-Anti-IgM höhere Signale als die von DyLight 549 anti-humanem IgM erzeugten Signale. Bei der Bestimmung der ACE2-prozentigen Hemmung der IgM-Bindung gab es einen leichten, aber unbedeutenden Unterschied zwischen den beiden IgM-Erkennungsreagenzien.
Einer der wichtigsten Schritte im Verfahren besteht also darin, Ihren Multiplex-Perlenmix aus Ihren individuellen Perlenbeständen vorzubereiten und sicherzustellen, dass Sie dies richtig tun. So kann dieses Verfahren auch zur Messung der Wirksamkeit von Impfstoffen und zur Überwachung der Immunantwort auf andere Krankheitserreger eingesetzt werden.
