Unser Protokoll beschrieb die Verwendung von fluoreszierendem oder lumineszierend exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2 für die In-vivo- und Ex-vivo-Live-Bildgebung und das virale Tracking im transgenen K18-ACE2-Mausmodell der SARS-CoV-2-Infektion. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Anwendung und Durchführbarkeit des viralen Nachweises und Trackings für In-vivo- und Ex-vivo-Studien von SARS-CoV-2 im transgenen K18-Modell der transgenen ACE2-Maus. Die Verwendung der In-vivo-Bildgebung von SARS-CoV-2 im transgenen K18-Modell der humanen ACE2-Maus stellt eine ausgezeichnete Option dar, um Therapeutika zur Behandlung von SARS-CoV-2-Infektionen in vivo zu evaluieren.
Die Implementierung von Reportern SARS-CoV-2 stellt eine ausgezeichnete Option dar, um Pathogenität, Virusreplikation und Trophismus in vivo zu bewerten. Für In-vivo-Studien mit Luciferase, die SARS-CoV-2 exprimieren, wird empfohlen, die Mäuse zu rasieren und nach der Substratinjektion eine sofortige Bildgebung durchzuführen, um das Biolumineszenzsignal zu verbessern. Beginnen Sie mit der Biolumineszenzüberwachung, indem Sie das In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) initiieren und die Parameter einrichten, klicken Sie auf den Bildmodus auf Biolumineszenz, öffnen Sie dann den Filter und stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto.
Als nächstes entfernen Sie eine bereits rasierte und betäubte Maus aus der Isolationskammer und verwenden Sie eine 25-Gauge-Nadel, um 100 Mikroliter des 1 bis 10 in PBS verdünnten Luciferase-Substrats retro-orbital auf die Maus zu verabreichen. Legen Sie dann die Maus zurück in die Isolierkammer, übertragen Sie die Isolationskammer an die IVIS-Maschine, die mit einer Heizkomponente ausgestattet ist, um Unterkühlung zu verhindern, und schließen Sie die IVIS-Imager-Tür, um die Bildgebung zu initialisieren, indem Sie im Softwareprogramm Acquire auswählen. Um die aufgenommenen Biolumineszenzbilder zu analysieren, verwenden Sie das ROI- oder Region of Interest-Tool in der Software, um das genaue Signal zu bestimmen und den Fluss zu messen.
Starten Sie die Imaging-Software und richten Sie die Parameter ein. Klicken Sie im Bildmodus auf Fluoreszenz, stellen Sie die Anregung auf 500 Nanometer und die Emissionsfilter auf 530 Nanometer ein und stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto ein. Führen Sie Nektroskopie durch und entfernen Sie Lungen von Mäusen.
Legen Sie die ausgeschnittenen Lungen in eine 6-Well-Platte, die zwei Milliliter 1X PBS enthält, und spülen Sie sie ab, um überschüssiges Blut zu entfernen. Desinfizieren und reinigen Sie chirurgische Werkzeuge zwischen den Proben mit 70% Ethanol. Nachdem Sie das IVIS-Gerät initialisiert haben, legen Sie die Lungen auf ein schwarzes Blatt und trennen Sie die Gewebe voneinander.
Legen Sie dann das Tablett in die Isolierkammer in der Biosicherheitskabine und übergeben Sie dann die Isolierkammer in das IVIS. Schließen Sie die Tür des IVIS-Imagers und klicken Sie auf Erfassen, um das Bildgebungssystem zu starten. Um die Fluoreszenz zu analysieren, verwenden Sie das ROI-Tool und zeichnen Sie ROIs um jede der einzelnen Lungen.
Messen Sie jeden ROI manuell und verwenden Sie dann die angegebenen durchschnittlichen Strahlungseffizienzwerte und subtrahieren Sie von den Schein-infizierten Mäusen. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, legen Sie das Gewebe in eine Kryotube, um das Trockeneis einzufrieren, um es bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verarbeitung zu lagern. Unter Verwendung des aus den Gewebehomogenaten erhaltenen Supernats führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung durch und infizieren konfluierende Monoschichten von Vero E6-Zellen mit einem Milliliter jeder überstehenden Verdünnung in Verdreifachungen.
Lassen Sie das Virus eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%Kohlendioxid-Inkubator adsorbieren. Sobald dies erledigt ist, waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter 1X PBS und inkubieren Sie die Zellen dann in zwei Millilitern Postinfektionsmedien mit 1% Agar im befeuchteten 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 72 Stunden. Nach der Inkubation inaktivieren Sie die Platten in 10% neutralem gepuffertem Formalin für 24 Stunden bei vier Grad Celsius, um sicherzustellen, dass die gesamte Platte untergetaucht ist.
Nehmen Sie die Platten aus der Biosicherheitsstufe drei und waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter 0,5% Triton X-100 für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes blockieren Sie die permeabilisierten Zellen mit einem Milliliter 2,5 Rinderserumalbumin oder BSA und PBS für eine Stunde bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einer Inkubation in einem Milliliter von einem Mikrogramm pro Milliliter des SARS-CoV-Nukleokapsidproteins kreuzreaktiver monoklonaler Antikörper 1C7C7, der in 2,5 BSA für eine Stunde bei 37 Grad Celsius verdünnt wurde. Waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter 1X PBS und entwickeln Sie die Plaques mit den ABC- und Diaminobenzol- oder DAB-Peroxidase-Substrat-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers und berechnen Sie dann die viralen Titer als plaquebildende Einheiten pro Milliliter.
In der Studie wurde beobachtet, dass die biolumineszente Nanoluciferase oder Nluc leicht nachgewiesen wurde und Mäuse mit dem rSARS-CoV-2 Nluc infiziert waren, aber nicht diejenigen, die mit rSARS-CoV-2 Wildtyp oder Mock infiziert waren. Die quantitativen Analysen zeigten die Nluc-Intensität an verschiedenen Tagen nach der Infektion. Die groben Läsionen auf der Lungenoberfläche von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2 Nluc infiziert waren, waren vergleichbar mit denen in der rSARS-CoV-2-Wildtyp-infizierten Gruppe.
Darüber hinaus wurden virale Titer nachgewiesen und die rSARS-CoV-2 Nluc-infizierten Mäuse waren vergleichbar mit denen, die an verschiedenen Tagen nach der Infektion mit dem rSARS-CoV-2-Wildtyp in allen Organen infiziert waren. Gleichzeitig wurde die Nluc-Aktivität nur in den Organen von rSARS-CoV-2 Nluc-infizierten Mäusen nachgewiesen. Eine separate Gruppe von Schein- und Virus-infizierten Mäusen wurde 12 Tage lang auf Veränderungen des Körpergewichts und des Überlebens überwacht.
Mäuse, die mit rSARS-CoV-2 Nluc und rSARS-CoV-2 Wild-Typ infiziert sind, verloren bis zu 25% ihres Körpergewichts und alle erliegen zwischen sieben und acht Tagen nach der Infektion einer Virusinfektion. Nach einer rSARS-CoV-2-Venusinfektion wurde die Venusexpression in allen Lungen von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2 Venus infiziert waren, leicht nachgewiesen, aber nicht von solchen, die mit rSARS-CoV-2 Wildtyp oder Scheininfektion infiziert waren. Die quantitativen Analysen zeigten, dass die Intensität der Venus zwei Tage nach der Infektion ihren Höhepunkt erreicht und im Verlauf der Infektion und der Lunge infizierter Mäuse abnimmt.
Bilder der Lungenoberfläche zeigten, dass grobe Läsionen von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2 Venus infiziert waren, mit denen von rSARS-CoV-2-Wildtyp-infizierten Mäusen vergleichbar waren. Auch die Infektion mit rSARS-CoV-2 Venus führte zu vergleichbaren viralen Titern wie bei Mäusen, die in allen Organen mit dem Wildtyp rSARS-CoV-2 infiziert waren. Die mit rSARS-CoV-2 Venus und rSARS-CoV-2 Wildtyp infizierten Mäuse verloren bis zu 25% ihres Körpergewichts und erlagen am neunten Tag nach der Infektion einer Virusinfektion ohne Überleben.
Die Ergebnisse von Reportern, die SARS-CoV-2 exprimieren, haben sich als gültige Surrogate einer Virusinfektion erwiesen. Dies könnte somit zu einer schnellen Identifizierung und Bewertung von Gegenmaßnahmen zur Behandlung der SARS-CoV-2-Infektion führen.
