Dieses Protokoll ist eine sehr einfache und effiziente Möglichkeit, Mutanten zu erkennen, die durch die CRISPR/Cas9-Technologie von zahlreichen Individuen erzeugt werden. Die beiden Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie in wenigen Stunden durchgeführt werden kann und dass sie auf eine Vielzahl von Organismen anwendbar ist. Das Primer-Design kann für bestimmte Gene eine Herausforderung darstellen, und es können mehrere Runden des Primer-Designs und der Verifizierung erforderlich sein, um HRMA effizient zu machen.
Um eine Verlaufs-PCR durchzuführen, beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Master-Mixes. Entfernen Sie dann 19 Mikroliter der Mastermischung für die Nicht-Template-Steuerung oder NTC in einer 96-Well-Platte. Fügen Sie dann die Vorlage dem verbleibenden Master-Mix hinzu.
Aliquot 20 Mikroliter der Probe mischen sich in die 96-Well-Platte. Führen Sie eine PCR nach den Zyklusparametern durch und generieren Sie dann die thermischen Schmelzeprofile unter Verwendung der im Manuskript genannten Parameter. Nachdem Sie das gesamte erforderliche Material gesammelt haben, bereiten Sie eine Mastermischung mit 0,5 Mikrolitern des DNA-Freisetzungsreagenzes und 20 Mikrolitern Verdünnungspuffer pro zu genotypisierendem Individuum vor.
Mit einem Mehrkanalpipet werden 20 Mikroliter der Mischung aliquot in eine PCR-Platte gegeben und die PCR-Platte auf Eis gelassen. Als nächstes legen Sie die betäubten G1-Moskitos in eine Glas-Petrischale, um sie sediert zu halten, und legen Sie acht Wildtyp-Moskitos in die zweite Petrischale. Wischen Sie eine Pinzette mit 70% Ethanol ab und verwenden Sie die desinfizierte Pinzette, um eines der Hinterbeine der Moskitos zu entfernen.
Tauchen Sie dann das Bein in die DNA-Freisetzungsreagenzienlösung. Legen Sie die Mücke in die entsprechende Durchstechflasche und schließen Sie die Durchstechflasche mit einem Schwamm. Sobald Sie fertig sind, wischen Sie die Pinzette mit 70% Ethanol ab, bevor Sie das Bein von der nächsten Mücke entfernen, bis die 96-Well-Platte fertig ist.
Später versiegeln Sie die Platte mit einer optischen PCR-Plattenversiegelung und inkubieren Sie die PCR-Platte mit den Beinen bei Raumtemperatur für zwei bis fünf Minuten, gefolgt von einer Inkubation bei 98 Grad Celsius für zwei Minuten. Lassen Sie die Platte auf Raumtemperatur abkühlen. Bereiten Sie für die PCR eine Mastermischung vor, die die bevorzugten Komponenten enthält, und verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um 19 Mikroliter der Mastermischung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte zu übertragen.
Nachdem Sie einen Mikroliter der DNA-Freisetzungslösung, die zuvor vorbereitete Mücken-DNA enthält, auf die Platte übertragen haben, versiegeln Sie die Platte mit einer optischen PCR-Plattenversiegelung. Führen Sie die PCR mit den entsprechenden Zyklusparametern durch, um thermische Schmelzeprofile gemäß den im Manuskript beschriebenen Parametern zu erzeugen, und untersuchen Sie dann die Schmelzeprofile, indem Sie dem Referenzcluster eine Wildtyp-Kontrolle zuweisen. Markieren Sie die verschiedenen Cluster mit den entsprechenden Farben auf der 96-Well-Vorlage.
Wählen Sie als Nächstes die Individuen mit interessanten Kurven aus und entfernen Sie die ausgewählten Individuen aus den Röhren zum hinteren Kreuz. Blut füttern die gemachten Weibchen, gefolgt vom Sammeln von G2As. In der repräsentativen Analyse wird die Sequenzanalyse der ZIP11-Mutante von Aedes aegypti gezeigt.
Das Elektropherogramm von Aedes aegypti ZIP11 heterozygoten Mutanten zeigte die Nukleotidposition an, in der der Indel auftrat. Der Indel wird durch eine Verschiebung von einfachen zu doppelten Peaks dargestellt, da polymorphe Positionen beide Nukleotide gleichzeitig zeigen. Am Ende des Laufs wurde die Anzahl der gelöschten oder eingefügten Basenpaare durch Zählen der einzelnen Peaks berechnet.
Mücken, die Mutationen in den Genen Aedes aegypti ZIP11 und myo-fem enthielten, wurden genotypisiert und mit der hochauflösenden Schmelzanalyse von HRMA sequenziert. Die Fluoreszenzsignale der Proben wurden auf relative Werte von eins bis null normiert. Zusätzlich wurde jede Kurve von der Wildtyp-Referenz subtrahiert und mit der entsprechenden Vergrößerung versehen.
In den repräsentativen Ergebnissen wird eine fehlgeschlagene automatische Clusterzuordnung angezeigt, bei der keine richtige Unterscheidung zwischen den Gruppen vorgenommen wurde. Darüber hinaus wurde jede Probe einzeln analysiert und den richtigen Gruppen zugeordnet, basierend auf der Ähnlichkeit mit Referenzproben von Heterozygoten, Homozygoten und Transheterozygoten. Nach der Durchführung von HRMAs ist die Sequenzierung der DNA der mutierten Individuen notwendig, um die Indels zu analysieren und die anderen Mutationen in der Zielsequenz zu identifizieren.
