Das übergeordnete Ziel des folgenden Methodenartikels ist es, ein Protokoll zu demonstrieren, das nützlich ist, um RNA-Wechselwirkungen mit Proteinen oder anderen Faktoren unter Verwendung einer optischen Pinzette in Verbindung mit konfokaler Mikroskopie zu untersuchen. In den letzten zehn Jahren wurden mehrere ausgeklügelte Techniken entwickelt, um die Eigenschaften einzelner Makromoleküle zu untersuchen. Eine dieser Techniken ist eine optische Pinzette mit einem Molekül.
Mit der neuen fluoreszenzgestützten optischen Pinzette können nicht nur kräfte, die für die Entfaltung von RNA-Molekülen benötigt werden, sondern auch Bindungsereignisse während der Translation detailliert überwacht werden. Hier konzentrieren wir uns auf Messungen, bei denen RNA-Moleküle mit und ohne Transaktionsfaktoren gedehnt werden, die die Translation regulieren. Wir veranschaulichen auch, wie die Technik angewendet werden kann, um die Translation mit markierten Ribosomen zu überwachen.
Das Protokoll wird von zwei Doktoranden meiner Gruppe, Lukas Pekarek und Stefan Park, demonstriert. In diesem Video führen wir Sie durch die Einrichtung und Durchführung eines optischen Pinzettenexperiments. Wir skizzieren auch den einfachen Datenanalyse-Workflow.
Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie unkompliziert und robust ist. Ein Molekül wird zwischen zwei Kügelchen gebunden, im Fokus von Laserstrahlen festgeschnallt, und in sogenannten Force-Ramp-Experimenten können Änderung und Kraft bei Verschiebung präzise gemessen werden. Sekundärstrukturen innerhalb eines Seils entfalten sich bei einer bestimmten Kraft, abhängig von der inneren Energie des Moleküls.
Dieser dynamische Übergang zwischen mehreren Strukturen kann mit konstanten Kraftmessungen weiter untersucht werden. Darüber hinaus kann der parallele Einsatz der Fluoreszenzbildgebung genutzt werden, um Bindungsereignisse in Echtzeit sichtbar zu machen. Ein ausgeprägtes Kraft-Weg-Profil eines Seils kann nach der Bindung potenzieller Transaktionsfaktoren, die seine Stabilität beeinflussen, variieren.
Zunächst muss die interessierende RNA in einen DNA-Vektor kloniert werden. Vor und nach dieser Sequenz werden zusätzliche Teile, die Griffe benötigt, um das endgültige DNA-RNA-Konstrukt zwischen den Kügelchen zu binden. Nach erfolgreichem Klonen und Amplifikation des Plasmids werden drei verschiedene PCR-Reaktionen durchgeführt.
Mischen Sie für jede PCR-Reaktion die Reagenzien gemäß Tabelle eins im Protokoll. Führen Sie die PCR in 50 Mikroliter-Aliquots in einem geeigneten thermischen Cycler durch. Die erste führt zu einer doppelsträngigen DNA des gesamten Konstrukts mit dem T7-Promotor für die anschließende In-vitro-Transkription.
Die zweite PCR erzeugt die fünf Prime-Griffe. Während die letzte Reaktion zu den drei Prime-Griffen führt. Sowohl 5 Prime- als auch 3 Prime-Griffe müssen entsprechend den verwendeten Perlen gekennzeichnet werden.
Die drei Prime-Griffe werden während der PCR mit einem Digoxigenin-markierten Reverse-Primer markiert, und die fünf Prime-Griffe müssen in einem zusätzlichen Schritt durch Biotinylierung markiert werden. Die drei Prime-Biotinylierung der fünf Prime-Griffe erfolgt unter Verwendung von T40 und einer Polymerase. Die Reaktion wird für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Als nächstes führen Sie die In-vitro-Transkription mit T7-Polymerase durch. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad für zwei bis vier Stunden, abhängig von der Länge der RNA. In einem letzten Schritt werden die Handles mit der RNA aus der in-vitro-Transkription geglüht, um das endgültige DNA-RNA-Konstrukt mit der einzelsträngigen Region von Interesse zwischen den doppelsträngigen Handles zu erhalten.
Um den gewünschten RNA-DNA-Hybrid zu glühen, mischen Sie die Griffe und die RNA in Glühpuffer. Die Glühmischung 10 Minuten lang auf 85 Grad erhitzen und dann die Probe langsam auf vier Grad abkühlen lassen. Mischen Sie die geglühte Probe mit 1/10 Volumen von drei molaren Natriumacetat und drei Volumen eiskaltem Ethanol und inkubieren Sie minus 80 Grad für mindestens eine Stunde.
Zentrifugieren Sie die Proben bei 15.000 xg für 30 Minuten bei vier Grad. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet unter Vakuum. Kleine Aliquots des resuspendierten Pellets werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zu ihrer Verwendung bei minus 80 Grad gehalten.
Entfernen Sie zuerst das Bleichmittel aus den Spritzen und füllen Sie einen ml RNase-freies Wasser ein. Fügen Sie 50 Mikroliter 0,5 molares Natriumthiosulfat hinzu und waschen Sie das System mit einem Riegel. Achten Sie darauf, dass das mikrofluidische System niemals trocken läuft, um Luftblasen im System zu vermeiden.
Als nächstes verwerfen Sie die verbleibende Natriumthiosulfatlösung und ersetzen Sie die Spritzen durch neue. Anschließend erneut mit mindestens 0,5 ml RNase-freiem Wasser waschen. Um das optische System der Maschine einzurichten, geben Sie zwei Tropfen Tauchöl auf das Objektiv.
Setzen Sie die Flusszelle ein und heben Sie das Ziel an, bis die Flüssigkeit die Flusszelle berührt. Dann geben Sie zwei Tropfen Tauchöl auf die Durchflusszelle. Schalten Sie nun die Trap-Steuereinheit und den Trapping-Laser ein.
Das Objektiv wird mit dem Z-Finder-Tool der Diagnosekameras der Maschine eingestellt. Durch Drehen der Mikroschraube wird die Z-Achse auf die Mitte der Kammer zwischen der zweiten und der dritten Reflexion eingestellt. Wo die Brechungsringe am größten sind.
Schalten Sie die Diagnosekameras in den Mondmodus und reduzieren Sie den Fanglaser auf etwa 50%, dann senken Sie den Kondensator und passen Sie seine Position an, so dass Sie ungefähr 10 Lichtbänder sehen. Die Messkammer hat fünf Kanäle, und vor dem Experiment sollten verschiedene Rüstmöglichkeiten in Betracht gezogen werden. Für ein einfaches Force-Ramp-Experiment ist beads-buffer-beads eine bequeme Kanalanordnung.
Für Messungen mit der vierten Verbindung, wie fluoreszierende Ribosomen oder Transaktionsfaktoren, ist der Perlen-Perlen-Pufferfaktor eine bessere Anordnung, aber es macht es schwieriger, Perlen zu fangen. Ein Aliquot des geglühten Konstrukts wird mit drei Mikroliter AD-Perlensuspension, einem Mikroliter RNase-Inhibitor und acht Mikroliter des Assay-Puffers bei Raumtemperatur für 10 bis 20 Minuten inkubiert. Anschließend wird die Probe in 500 Mikroliter Assay-Puffer verdünnt und in den jeweiligen Kanal gegeben.
Für die zweite Art von Kügelchen werden 0,8 Mikroliter Assay-Kügelchen mit einem ml Assay-Puffer gemischt und in den entsprechenden Kanal verabreicht. Die Kanäle werden geöffnet und mit niedrigem Druck gewaschen. Schalten Sie nun den Fanglaser ein.
Um Perlen aufzufangen, werden die Laser voneinander entfernt und eine AD-Perle wird in Falle eins gefangen. Als nächstes wird die Stufe zum SA-Perlenkanal bewegt und eine Perle wird in Falle zwei gefangen. Um den Verlust der Perlen zu vermeiden oder eine zweite in derselben Falle zu fangen, wird die Bühne in den Pufferkanal verschoben und alle Kanäle werden geschlossen.
Im Puffer wird eine Trap-Kalibrierung durchgeführt. Die gefangenen Perlen sollten als visuelle Vorlagen für nachfolgende Messungen festgelegt werden. Und der Ähnlichkeitswert sollte zwischen den Messungen über 90% gehalten werden, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
Schließlich werden die Perlen näher zusammengeschoben und man kann anfangen, ein einzelnes Seil zu fangen. Dies geschieht, indem die Perlen für einige Sekunden nahe bewegt werden und dann langsam wieder die Perlen verlassen werden. Eine Tetherbildung führt zu einer Erhöhung der gemessenen Kraft, wenn die beiden Perlen voneinander weggezogen werden.
Die Anzahl und Qualität der Haltegurte kann überprüft werden, indem das überdehnte Plateau gefunden und die Flugbahn mit dem frei gelenkigen Ketten- oder wurmartigen Kettenmodell verglichen wird. Das überdehnte Plateau sollte zwischen 50 und 60 Piconewton für ein einzelnes Seil liegen. Um die Fluoreszenzmessungen durchzuführen, schalten Sie die konfokalen Laser und die Photonenzählung an der Einheits- und optischen Pinzette ein.
Schalten Sie anschließend den Anregungslaser der gewünschten Wellenlänge und die Softwareschnittstelle ein und stellen Sie die Leistung des Lasers je nach Fluorophor auf 5% oder höher ein. Nun kann die Bildgebung über die Bild- oder Kymographenfunktionen der Software gestartet werden. Um gut fokussierte Bilder zu erhalten, stellen Sie sicher, dass die Brennebene des konfokalen Mikroskops und die optischen Fallen ausgerichtet sind.
Zu diesem Zweck kann die Autofluoreszenz der Polystyrolperlen im blauen Laserkanal eingesetzt werden. Bewegen Sie sich mit der Brennebene der optischen Fallen auf und ab, bis die Autofluoreszenz der Perlen ihren höchsten Durchmesser erreicht. An dieser Stelle können die am angebundenen Molekül ablaufenden Fluoreszenzsignale detektiert werden.
Für beide Funktionen ist es wichtig, die entsprechenden Interessensgebiete auszuwählen. Während der gesamten Messung kann die Pufferzusammensetzung leicht geändert werden, indem entweder die Kügelchen in verschiedene Kanäle bewegt werden oder indem der im mikrofluidischen System bereitgestellte Puffer geändert wird. Um Photobleichen zu vermeiden, schalten Sie den Anregungslaser immer aus, wenn Sie nicht messen.
Die Rohdatenausgabe des Geräts enthält oft viel Rauschen. Um verstreute Daten weiter analysieren zu können, muss man sie daher zunächst vorverarbeiten. Der erste Schritt besteht darin, die Proben zu entnehmen und die Daten mit dem Tiefpass-Butterworth-Filter zu filtern, gute Ergebnisse wurden erzielt.
Für Kraftrampenexperimente müssen die Entfaltungsereignisse an den entsprechenden gefalteten und entfalteten Bereichen der ersten Abstandskurve markiert werden, die mit wurmartigen Ketten- oder freigelenkten Kettenmodellen angebracht werden können. Für die konstanten Kraftdaten kann der Abstand über die Zeit aufgezeichnet werden und es ist nützlich, ein Histogramm zu erstellen, um die vorherrschende Konformation bei einer gegebenen Kraft zu quantifizieren. Hier wird gezeigt, dass die Filterparameter entscheidend sind, um verschiedene Falzzustände zu unterscheiden.
Um besser zu verstehen, was mit dieser Technik erreicht werden kann, werden einige repräsentative Ergebnisse gezeigt. So sieht eine Standard-Kraft-Abstands-Kurve aus einem Kraftrampenexperiment aus. In diesem Fall haben wir das SARS-Coronavirus-2-Frame-Shifting-Element untersucht.
Wir beobachteten die Entfaltung in mehreren Schritten um 15 Piconewton. Wenn die Richtung umgekehrt ist und die Perlen wieder näher kommen, faltet sich das Seil mit etwas geringerer Kraft wieder zurück. Als wir die gleiche RNA in Gegenwart des antiviralen Zinkfingerproteins ZAP maßen, wurde ein ähnliches Muster der Entfaltung beobachtet.
Aber die sekundäre Struktur der RNA faltete sich nicht neu. Dies ist ein gutes Beispiel, um zu zeigen, welchen großen Einfluss die Proteinbindung auf die RNA-Kinetik haben kann. Anhand konstanter Kraftdaten kann die sich entfaltende Kinetik weiter untersucht werden.
Die Entfernung über die Zeit wird für verschiedene Kräfte aufgetragen und das Histogramm der verschiedenen beobachteten Zustände wird auf der rechten Seite hinzugefügt. Bei 10 Piconewton befindet sich die RNA vollständig im gefalteten Zustand. Bei 11,5 Piconewton wechselt es zwischen den Zuständen, und bei 13 Piconewton befindet sich die RNA dauerhaft in einem entfalteten Zustand.
Als jedoch das SARS-Coronavirus-2-Frame-Shifting-Element zusammen mit ZAP gemessen wurde, befand sich die RNA bei 11 Piconewton vollständig in einem entfalteten Zustand und zeigte bei 10 Piconewton sogar nur einen sehr geringen Übergang zu einem gefalteten Zustand. Dies deutet darauf hin, dass ZAP an das einzelsträngige Rahmenverschiebungselement bindet und die Bildung einer Sekundärstruktur verhindert. Schließlich werden wir uns einige optische Pinzettendaten in Verbindung mit konfokaler Mikroskopie ansehen.
In diesem Experiment wurde ein Fluoreszenzfarbstoff verwendet, der doppelsträngige Nukleinsäuren markiert, nicht spezifisch mit zunehmender Kraft. Der Kymograph zeigt, dass, wenn die Perlen voneinander entfernt werden, die Fluoreszenzintensität zunimmt und vollständig verschwindet, sobald das Band zu stark gedehnt wird und bricht. In der letzten Abbildung wurden fluoreszierend markierte Ribosomen durch Kanal vier hinzugefügt.
In diesem Experiment wurde eine spezifische Ribosomenbindung an den RNA-Tether beobachtet. Wir hoffen, dass dieses Video Ihnen einen Einblick in die optische Pinzette gegeben hat und was mit dieser unglaublichen Technik durchgeführt werden kann.
