Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Verfahren zu beschreiben, die an der Durchführung einer irreproduziblen Ischiasnervenzerkleinerung beteiligt sind, und ein Protokoll für die Beurteilung des motorischen Verhaltens nach peripheren Traumata bereitzustellen. Die Auswahl einer leistungsstarken und zuverlässigen Verhaltenstestbatterie ist unerlässlich, um ein breites Spektrum von Verhaltensaspekten abzudecken, und hängt vom verwendeten Tiermodell und der wissenschaftlichen Forschungsfrage ab. Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie eine Ischiasnervenquetschverletzung durchgeführt wird, und stellt eine Verhaltenstestbatterie zur Beurteilung motorischer Defizite bei Ratten bereit, die den Freifeldtest, die CatWalk-Ganganalyse, die Strahllaufaufgabe und die Leitersprosselaufaufgabe umfasst.
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den geltenden nationalen und institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt. Halten Sie während des gesamten chirurgischen Eingriffs eine sterile Umgebung aufrecht. Stellen Sie den Operationstisch mit der notwendigen Ausrüstung auf.
Betäuben Sie die Ratte tief in einem geschlossenen Schrank mit Isofluran und rasieren Sie einen ausgedehnten Bereich der rechten Hintergliedmaße. Als nächstes positionieren Sie die Ratte in der Anästhesiemaske und setzen Sie die Tiefenanästhesie mit Isofluran fort. Befestigen Sie den Oberkörper und beide Hinterbeine der Ratte mit Klebeband.
Legen Sie beide Hinterbeine in eine symmetrische und ausgestreckte Position und drehen Sie jede Pfote flach auf den Operationstisch. Desinfizieren Sie die Haut des rasierten Bereichs mit einem geeigneten Antiseptikum. Suchen Sie nach der Ischias-Notbe des Ileums.
Machen Sie einen Hautschnitt von der Ischias-Notch in Richtung Der Pfote mit einem Skalpell. Wenn die Hintergliedmaßen fixiert sind und der Hautschnitt korrekt durchgeführt wird, kann ein Hohlraum in der Faszienebene zwischen dem Musculus gluteus maximus und dem Musculus biceps femoris gesehen werden, der einer weißen Linie ähnelt. Führen Sie eine geschlossene superfeinheitliche hämostatische Hemostasette in den Hohlraum ein und verteilen Sie die Zette.
Die Faszienebene sollte sich öffnen, ohne Muskelgewebe zu verletzen. Legen Sie die Gummibandretraktoren unter die Muskeln, um den Hautschnitt offen zu halten. Entfernen Sie vorsichtig das umliegende Gewebe und die Blutgefäße aus dem Ischiasnerv, bis der Nerv vollständig freigelegt ist.
Es ist wichtig, den Nerv während des gesamten Eingriffs nicht zu dehnen oder zu ziehen. Zerquetschen Sie den Ischiasnerv mit einer nicht gezackten Klemme mit konstantem und schnell nutzbarem Druck. Öffnen Sie dazu die Klemme, legen Sie den Nerv auf den Unterkiefer der Klemme und schließen Sie die Klemme, indem Sie sie für 3 x 10 Sekunden in die erste Position sperren.
Öffnen Sie die Klemme nach der Quetschverletzung vorsichtig wieder. die Quetschstelle des Ischiasnervs erscheint durchscheinend. Entfernen Sie die Gummibandretraktoren.
Schließen Sie den Schnitt der Faszienebene mit einer resorbierbaren Naht. Schließen Sie den Hautschnitt mit Körperhautklammern. Die Bewegungsaktivität sowie die Verhaltensaktivität von Ratten können durch einen Offenfeldtest analysiert werden.
Der Aufbau des offenen Feldes, das sich in einer dunklen und ruhigen Umgebung befinden sollte, besteht aus dem automatisierten Video-Tracking-System EthoVision XT und einer Arena mit einer kratzfesten, reinigbaren schwarzen Oberfläche. Platzieren Sie die Arena und die Kamera in die richtige Position und richten Sie die EthoVision XT Software ein. Platzieren Sie die Ratte vorsichtig in der Mitte der Testarena.
Während der Aufnahme sollte sich der Experimentator von dem offenen Feld fernhalten, um die Ratte nicht abzulenken. Für die Datenanalyse des offenen Feldtests gehen Sie zum Analyseabschnitt in der linken Seitenleiste und wählen Sie "Visualisierung verfolgen" unter der Registerkarte "Ergebnisse". Als nächstes exportieren Sie die benötigten Parameter nach XL.Wählen Sie in der Software eine Reihe von Variablen aus verschiedenen Kategorien für die Datenanalyse aus.
Eine Ganganalyse durch das CatWalk XT System kann helfen, viele verschiedene Parameter bezüglich Fußabdrücke, Haltung und Gang von Tiermodellen zu beurteilen. Ein Glassteg wird mit grünem Licht beleuchtet und das von den Fußabdrücken der Tiere gestreute Licht wird mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera eingefangen, die sich unter dem Gehweg befindet. Die Signale können mit der CatWalk XT Software analysiert werden.
Das Experiment muss unter dunklen Bedingungen durchgeführt werden. Beginnen Sie mit der Einrichtung des CatWalk XT-Systems. Wählen Sie die experimentellen Einstellungen aus.
Platzieren Sie die Kamera in Position und stellen Sie den Fokus ein. Richten Sie die Erkennungseinstellungen ein. Richten Sie die Korridorwände des CatWalk-Systems ein und stellen Sie sicher, dass die Wände parallel zum Gehweg bleiben.
Definieren Sie die Länge des Gehwegs und kalibrieren Sie den Gehweg. Als Nächstes fangen Sie ein Hintergrundbild an. Für das Hintergrundbild wird ein sauberer und leerer Gehweg benötigt.
Die Ratte sollte den Gehweg ohne Unterbrechung überqueren. Gemäß den definierten Laufkriterien werden für die Datenanalyse drei konforme Läufe pro Ratte benötigt. Trainiere Tiere mindestens acht Tage lang, bevor du mit dem eigentlichen Experiment beginnst.
Der CatWalk sollte mindestens einmal pro Woche mit 6 bis 10 Läufen durchgeführt werden, um eine kontinuierliche Aufgabenleistung zu gewährleisten. Für die Datenanalyse nur die konformen Läufe auswerten. Klassifizieren Sie Pfotenabdrücke automatisch mit der CatWalk XT Software.
Überprüfen Sie die Pfotendrucketiketten manuell. Korrigieren Sie falsche Pfotendrucketiketten, fügen Sie Etiketten mit nicht erkannten Pfotenabdrücken hinzu und löschen Sie alle Geräusche und falschen Etiketten. Die numerischen Ergebnisse werden in einem XL-Blatt angezeigt, das eine Reihe grundlegender Parameter anzeigt.
Für detailliertere Informationen über jeden Fußabdruck klassifizieren Sie die Zehen der Hinterpfoten. Diese Analyse erfordert das interaktive Footprint-Messmodul. Legen Sie die Marker für die Footprint-Analyse manuell fest.
Analysieren Sie jeden Hinterpfotenabdruck in allen drei konformen Durchläufen. Zeichnen Sie eine Linie von der Mitte des ersten Zeichnzes zur Mitte des fünften Zeichzeichnes, um die Zehenausbreitung zu messen. Zeichnen Sie eine Linie von der Mitte des zweiten Zeichnzes zur Mitte des vierten Zeichzeichnes, um die zwischengeschaltete Zehenausbreitung zu messen.
Zeichnen Sie eine Linie von der Mitte des dritten Zehs bis zur Ferse der Hinterpfote, um die manuelle Drucklänge zu messen. Überprüfen Sie die numerischen Ergebnisse der interaktiven Fußabdruckmessungen, die in einem separaten Blatt angezeigt werden. Gangdefizite können durch die Strahllaufaufgabe bestimmt werden.
Der Schwerpunkt der Beam Walking-Aufgabe in diesem spezifischen Forschungsthema wird die Analyse der motorischen Koordination und nicht die Bewertung der motorischen Balance sein. Für die Beam-Walking-Aufgabe werden ein Beam, ein Abstandhalter, ein Tisch, ein einheitlicher Hintergrund und ein Camcorder benötigt. Verwenden Sie einen Holzbalken von 90 Zentimetern Länge, 1,7 Zentimeter Breite und 2 Zentimeter Höhe.
Trainiere die Tiere sieben Tage lang. Legen Sie die Ratte auf die Startplattform des Balkens. Die Ratte sollte den Strahl dreimal ohne Unterbrechung überqueren.
Selbst wenn die Ratte innerhalb der ersten drei Läufe drei konforme Läufe erreicht, sollten mindestens 6 bis 10 Läufe für eine kontinuierliche Aufgabenleistung durchgeführt werden. Wählen Sie die Videosequenzen von drei kompatiblen Läufen aus der Aufnahme aus. Definieren Sie den Startzeitpunkt und den Endzeitpunkt der ausgewählten drei kompatiblen Durchläufe.
Hier wird der Startzeitpunkt durch eine schwarze Linie auf dem Balken markiert, und die Platzierung des ersten Hinterglieds hinter der schwarzen Linie wird als Startzeitpunkt des Laufs definiert. Die Platzierung der ersten Hintergliedmaße auf der Plattform am Ende des Balkens definiert den Endzeitpunkt. Als nächstes berechnen Sie die Zeit, die die Ratte benötigt, um den Strahl zu überqueren.
Bewerten Sie die Anzahl der Schritte und Fehler aus drei konformen Läufen für beide Hinterbeine separat, indem Sie die Zoom- und Zeitlupenfunktion der Software verwenden. Zu den Fehlern gehören totale Fußrutsche und halbe Fußrutschen. Ein totaler Fußschlupf ist definiert als eine Fußplatzierung, der ein tiefer Rutsch folgt, der zu einem Verlust des Kontakts der betroffenen Pfote mit dem Balken führt.
Ein halber Schlupf ist definiert als die Pfote, die von der Seitenwand des Balkens rutscht, ohne den vollständigen Kontakt zu verlieren. Berechnen Sie den Prozentsatz der Fußschlupfe im Verhältnis zur Anzahl der Schritte, die den Balken überqueren müssen. Die Leitersprosse-Gehaufgabe kann die motorische Funktion, die Platzierung der vorderen Gliedmaßen und der hinteren Gliedmaßen sowie die Koordination zwischen den Gliedmaßen beurteilen.
Für diesen Verhaltenstest werden ein Leitersprossengerät, ein Abstandhalter, ein Tisch, ein einheitlicher Hintergrund und ein Camcorder benötigt. Die horizontale Buchstabensprosse besteht aus Metallsprossen und klaren Polycarbonat-Seitenwänden. Trainiere die Tiere acht Tage lang.
Platzieren Sie die Ratte auf der Startzone der Leitersprossenoperatoren. Die Ratte muss den 100 Zentimeter großen Gehweg des Leitersprossengeräts dreimal ohne Unterbrechung überqueren, damit sie sich als konformer Lauf qualifizieren kann. Wählen Sie die Videosequenzen von drei kompatiblen Läufen aus der Aufnahme aus.
Definieren Sie den Startzeitpunkt und den Endzeitpunkt der ausgewählten drei kompatiblen Durchläufe. Die Platzierung der Hintergliedmaße hinter der ersten schwarzen Linie an der Seitenwand des Geräts definiert den Startzeitpunkt des Laufs. Die Platzierung des ersten vorderen Glieds hinter der zweiten schwarzen Linie an der Seitenwand des Geräts definiert den Endzeitpunkt des Laufs.
Berechnen Sie als Nächstes die Dauer des Laufs über den Gehweg. Bewerten Sie die drei konformen Läufe mit der 7-Kategorie-Skala von Mets und Kollegen, indem Sie die Zeitlupen- oder die Frame-by-Frame-Funktion der Software verwenden. Bestimmen Sie die Anzahl der Schritte und die Anzahl der Fehler gemäß den Kategorien der Skala für jedes Glied separat.
Die Skala unterscheidet zwischen den folgenden Kategorien. Totaler Fehlschlag. Tiefer Schlupf.
Leichter Ausrutscher. Ersatz.Korrektur. Teilplatzierung. Und korrekte Platzierung.
Als nächstes berechnen Sie die Fehler pro Schritt. Die repräsentativen Ergebnisse des fünfminütigen Freifeldtests zeigen, dass die Nervenquetschverletzung fünf Wochen nach der Operation keinen Einfluss auf die Bewegungsaktivität hat. Die Ganganalyse mit dem CatWalk XT System generiert viele verschiedene Parameter.
Signifikante Veränderungen konnten für die Laufdurchschnittsgeschwindigkeit, die Schrittlänge und den Druckbereich der nervenverletzten rechten Hinterpfote festgestellt werden. Nervenverletzte Wildtypratten zeigten eine signifikant erhöhte Latenzzeit, um den Strahl zu überqueren, verglichen mit wildtypnaiven Ratten fünf Wochen nach der Verletzung. Als zusätzliches Auslesen der Strahllaufaufgabe wurden Voll- und Halbrutschen der nervenverletzten Hintergliedmaße gezählt und als Fehler für die statistische Auswertung betrachtet.
Der Prozentsatz der Fehler pro Schritt der nervenverletzten rechten Hintergliedmaße war bei nervenverletzten Wildtypratten im Vergleich zu wildtypnaiven Ratten signifikant erhöht. Repräsentative Daten der Leitersprosse-Gehaufgabe zeigen keine signifikanten Veränderungen in der Latenzzeit, um den Gehweg des Leitersprossenapparates zu überqueren, oder im Prozentsatz der Fehler pro Schritt der nervenverletzten rechten Hintergliedmaße. Die Analyse des Fehlerprozentsatzes pro Schritt der nervenverletzten Hintergliedmaße berücksichtigte nur die Punktzahl von 0 bis 2 der 7-Kategorieskala von Mets und Kollegen.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Ischiasnervenquetschung durchführt und wie man eine multifaktorielle Bewertung des motorischen Verhaltens bei Ratten nach einseitiger Ischiasnervenzerkleinerung implementiert. Um konsistente, reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse nach einer Ischiasnervenquetschverletzung zu erzielen, ist eine standardisierte Methode zur Induktion des Nervenquetschs sowie eine standardisierte phänotypische Charakterisierung unerlässlich. Richtiges Training für spezifische Verhaltenstests bietet die Vorteile, Zeit während der Testbewertung zu sparen und bessere Ergebnisse zu erzielen.
