Alle Organismen haben eine Störung in ihrem Proteom, geschätzt bis zu 33%Diese Regionen sind durch Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie beobachtbar, jedoch nur im Millisekunden-Zeitbereich. Unser Protokoll zeigt Ihnen, wie Sie dies erfolgreich tun können. Dies ist eine vollautomatische Analysetechnik.
Du stellst einfach alles ein, programmierst die gewünschten Zeitmessungen, klickst auf Go und gehst weg. Diese Technik eröffnet die aufregende Möglichkeit, nach Verbindungen zu suchen, die spezifische Bestätigungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen wie Alpha-Synuclein stabilisieren. Um mit der Probenvorbereitung für die Peptidkartierung zu beginnen, nehmen Sie zunächst eine Durchstechflasche mit gespeichertem Alpha-Synuclein-Proteinbestand aus dem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius.
Und sobald es aufgetaut ist, filtern Sie mit einem 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter. Messen Sie dann die Absorption der Lösung bei 218 Nanometern, um die Proteinkonzentration mit dem Beer-Lambertschen Gesetz zu bestimmen, und verdünnen Sie das Protein mit Gleichgewichtspuffer auf eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren. Als nächstes, um den Autosampler-Roboter einzurichten, fügen Sie 50 Mikroliter der fünf mikromolaren Proteinlösung zu einer Gesamtrückgewinnungsdurchstechflasche hinzu und platzieren Sie die Durchstechflasche in der Probenposition in der rechten Kammer des Wasserstoff / Deuterium-Austauschs oder HDX, Robotik in Übereinstimmung mit dem Massenspektrometer.
Legen Sie dann eine Durchstechflasche mit Gleichgewichtspuffer und zwei Durchstechflaschen mit Pepsinkünschepuffer in die Reagenzpositionen eins, vier und fünf der linken Kammern und eine Durchstechflasche mit Abschreckpuffer, um eine in der rechten HDX-Kammer zu positionieren, und stellen Sie die Temperatur mit dem Peltier-Temperaturregler auf 20 Grad Celsius ein. Fügen Sie dann eine gleiche Anzahl von Gesamtrückgewinnungsfläschchen und Durchstechflaschen mit maximaler Rückgewinnung in den gleichen Reaktionspositionen der linken HDX-Kammer bzw. der rechten HDX-Kammer hinzu. Richten Sie anschließend eine Beispielliste mit entsprechenden LC- und MS-Methoden in der Planungssoftware ein und starten Sie den Zeitplan.
Um die endgültige Peptidabdeckungskarte zu erhalten, kuratieren Sie die Isotopenzuweisungen manuell in der DynamX HDX-Datenanalysesoftware. Öffnen Sie nach der Reinigung des Fast HDX-Prototyp-Instruments die grafische Benutzeroberfläche der kompatiblen HDX-Software, um das System zu initialisieren. Geben Sie 20 Grad Celsius bzw. 0,5 Grad Celsius als Probenkammer- bzw. Abschreckkammertemperatur ein, gefolgt von einem Klick auf Einstellen, um die neuen Temperaturen anzuwenden.
Um das Instrument zu reinigen und vorzubereiten, richten Sie die Zentrifugenröhrchen an allen Einlässen mit LC / MS-Wasser ein, überprüfen Sie dann sowohl die linke als auch die rechte Spritze in der Titrator-Sanitärzufuhrregisterkarte und klicken Sie weiter, bis alle latenten Luftblasen in den Röhrchen verschwunden sind. Um alle Kontrollkästchen für Spritzen zu aktivieren, gehen Sie zuerst zur Registerkarte Makros und klicken Sie auf die Ausgangsposition der Spritzen kalibrieren, dann zuerst auf Spritzenladeschleife waschen, gefolgt von allen Mischschleifenvolumina waschen. Wenn sich eine Blase in einer Pufferspritze befindet, trennen Sie die Spritze und entgasen Sie sie, indem Sie die Blase vertikal ausstoßen.
Ersetzen Sie die Spritze vor der Neukalibrierung auf die Nullposition. Um das Fast HDX-Prototypinstrument für HDX-Experimente einzurichten, führen Sie zunächst das linke Titrationseinlassrohr in die Durchstechflasche mit Gesamtrückgewinnung ein. Um eine temperaturbedingte Oligomerisierung und Aggregation zu verhindern, legen Sie das Rohr in einen Tischkühlschrank.
Als nächstes fügen Sie 50 Milliliter Gleichgewichts-, Beschriftungs-, Quench- und Pepsin-Waschpuffer zu den jeweiligen Puffereinlässen in der rechten und linken Kammer des Instruments hinzu, gefolgt von der Zugabe von 50 Millilitern Säulenwaschpuffer zum Pepsinkischeinlass. Um die Protein- und Säulenwaschlinien zu grundieren, überprüfen Sie die rechten und linken Spritzen auf der Registerkarte Titrator Plumbing Delivery und klicken Sie einmal auf Prime. Nachdem Sie alle Kontrollkästchen für Spritzen aktiviert haben, wie zuvor gezeigt, gehen Sie zur Registerkarte Manueller Abschreckfluss, um die erforderlichen Einstellungen einzugeben.
Verwenden Sie für ein Zeitkursexperiment die symbolische Punktschaltfläche, um die Zeiten in Millisekunden einzugeben. Stellen Sie dann die Trap-Zeit auf drei und warten Sie, bis die HPLC die Trap-Zeit plus Laufzeit plus 1,5 Minuten erreicht hat. Wenn leere Experimente zwischen Stichprobenläufen ausgeführt werden, klicken Sie auf das Feld leer ausführen, nachdem Sie nach jedem Beispiellauf einen Eintrag in der Erfassungssoftware für den leeren Lauf sichergestellt haben.
Sobald die Beispielliste fertig ist und die entsprechenden Einträge markiert wurden, starten Sie den Lauf, indem Sie in der Software auf Play und Fast HDX klicken. Öffnen Sie für die Datenverarbeitung das Dateimenü der Datei der spektral zugewiesenen Peptide aus den Peptidkartierungsexperimenten und klicken Sie in der DynamX-Software auf Öffnen, und importieren Sie dann die Rohdateien in die DynamX-Software. Nachdem Sie das Datenmenü geöffnet haben, klicken Sie auf MS Files.
Um Zustände für jeden untersuchten Proteinzustand zu erstellen, klicken Sie auf Neuer Zustand. Um jeden HDX-Zeitpunkt hinzuzufügen, klicken Sie auf Neue Belichtung und dann auf Neue Rohdaten. Um Rohdateien zu importieren, ziehen Sie jede Datei an die richtige Position und klicken Sie auf OK, wenn Sie fertig sind.
Nachdem Sie Isotopen automatisch zugewiesen haben, kuratieren Sie die Isotopenzuweisung manuell, um eine hohe Datenqualität zu gewährleisten. Exportieren Sie die Clusterdaten in der CSV-Datei mit der im Manuskript beschriebenen Spaltenreihenfolge. Öffnen Sie das Datenmenü in der Massenmesssoftware und klicken Sie auf Clusterdaten exportieren.
Für die Datenanalyse laden Sie zunächst die exportierten Clusterdaten in die HDX-Analysesoftware HDfleX. Um die experimentellen Daten für alle Experimente und Zustände anzupassen, wählen Sie die entsprechenden Back-Exchange-Korrekturmethoden aus, um die beobachteten Ratenkonstanten für die HDX-Reaktion zu erhalten. Berechnen Sie dann einen globalen Signifikanzschwellenwert mit einer bevorzugten Methode in HDfleX und führen Sie hybride Signifikanztests durch, um die signifikanten Unterschiede zwischen den verglichenen Staaten zu bestimmen.
Das Mapping-Experiment auf Alpha-Synuclein erzeugte eine Peptiddeckungskarte, die 100% der Proteinsequenz mit einer durchschnittlichen Redundanz von 3,79 abdeckte. Darüber hinaus ermöglichte dieses Protokoll die Generierung von Deuterium-Aufnahmekurven für verschiedene Peptide von Alpha-Synuclein, die dann als angepasste und rückaustauschkorrigierte Graphen exprimiert wurden. Es war offensichtlich, dass der größte Teil des Wasserstoff/Deuterium-Austauschs in Alpha-Synuclein um eine Sekunde abgeschlossen war.
Der Konformationsunterschied zwischen den Zuständen A und B von Alpha-Synuclein zeigte sich auch in der höheren Deuteriumaufnahme durch den Zustand B sowohl auf Peptid- als auch auf Aminosäureebene. Für eine so empfindliche Technik ist es wichtig, beim Vergleich von Daten robuste statistische Signifikanztests zu verwenden. Hier haben wir unsere Software HDfleX eingesetzt.
