Diese Kokulturmethode wird dazu beitragen, Schlüsselfragen rund um die Zellkontaktmechanismen hinter der mesenchymalen Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose zu beantworten und damit die Rolle von MSC bei der Regulierung der angeborenen Immunität zu beleuchten. Diese Technik kann in Hochdurchsatzanalysen angewendet werden. Die an pH-empfindlichen Farbstoffe konjugierten Biopartikel fluoreszieren nur in sauren Phagolysosom-Umgebungen.
Daher sind Waschen und Abschrecken notwendig. Diese Methode kann auch auf eine Vielzahl von Kokulturmodellen angewendet werden, die Neutrophile und andere Phagozyten umfassen. Das Verfahren wird Ethan Chetkof, ein Student, der sich derzeit in meinem Labor befindet, demonstrieren.
Beobachten Sie zunächst den Zusammenfluss von kultivierten mesenchymalen Stammzellen. Wenn eine Konfluenz von 70-80% erreicht ist, saugen Sie das Wachstumsmedium aus den kultivierten Zellen in einer 100-Millimeter-Schale ab und fügen Sie fünf Milliliter PBS hinzu. Nach dem Absaugen des PBS zwei Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und die Zellen drei Minuten lang inkubieren.
Überprüfen Sie nach drei Minuten die Zellablösung mit einem inversen Mikroskop. Und wenn die Zellen nicht abgelöst sind, inkubieren Sie erneut für ein bis zwei Minuten. Sobald alle Zellen abgelöst sind, fügen Sie fünf Milliliter frisches Wachstumsmedium auf die Platte hinzu.
Nachdem Sie die Platte mit der Trypsin-Medium-Mischung gespült haben, verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um die Zellen in einem sauberen, sterilen 50 Milliliter konischen Röhrchen zu sammeln. Als nächstes pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Nach dem Absaugen des Überstandes resuspenieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter frischem Wachstumsmedium, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren.
Für die Zellzählung fügen Sie 10 Mikroliter Zellsuspension in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit 30 Mikrolitern 0,4% Trypan Blue-Lösung hinzu und fügen dann 10 Mikroliter der Mischung unter dem Deckglas einer Hämozytometer-Zählkammer hinzu. Zählen Sie unter dem inversen oder Hellfeldmikroskop die ungefärbten lebensfähigen Zellen mit einer 10-fachen Objektivlinse und vier Ein-Quadrat-Millimeter-Kammern und berechnen Sie die Zellzahl wie im Textmanuskript beschrieben. Verwenden Sie die Gleichung C1V1 gleich C2V2, um das gewünschte Volumen des frischen Mediums und der Zellsuspension zu bestimmen, die erforderlich sind, um die Zellsuspension in einer Endkonzentration von einmal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter herzustellen.
Verwenden Sie einen Mehrkanal-Mikropipetter, um 100 Mikroliter der Zellsuspension in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte entsprechend dem Plattendesign hinzuzufügen. Verwenden Sie eine Mikropipette, um 530 Mikroliter der Zellsuspension entsprechend dem Plattendesign zu jedem der Kammerobjektträger hinzuzufügen und über Nacht zu inkubieren. Bereiten Sie 10 Milliliter Aktivierungsmedium mit Interferon gamma in einer Konzentration von 250 Nanogramm pro Milliliter vor, um die Makrophagenzellen in einer 100-Millimeter-Schale zu aktivieren.
Das Wachstumsmedium aus den Makrophagenzellkulturen absaugen und die Zellen mit fünf Millilitern des Aktivierungsmediums ohne Interferon gamma abspülen. Nach dem Absaugen des Spülmediums in der Versuchsschale werden 10 Milliliter Aktivierungsmedium, ergänzt mit Interferon gamma, zugegeben. Und in der Kontrollschale fügen Sie 10 Milliliter Aktivierungsmedium ohne Interferon gamma hinzu und inkubieren Sie dann die Zellen für 16 bis 24 Stunden.
Am Ende der Inkubation wird zur Vorbereitung der Cokulturen das Aktivierungsmedium aus den Makrophagenzellen entfernt und fünf Milliliter frisches Wachstumsmedium zugegeben. Verwenden Sie einen Zellheber, um die Zellen vorsichtig abzukratzen und die Zellen in einem 50 Milliliter konischen Rohr zu sammeln. Als nächstes zählen Sie die Zellen mit Trypan Blue-Ausschluss und Hämozytometrie, gefolgt von der Herstellung von Kontroll- und behandelten Makrophagenzellsuspensionen in der Konzentration von zweimal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter, wie zuvor für die mesenchymalen Stammzellen gezeigt.
Aspirieren Sie das Medium vorsichtig aus den experimentellen Vertiefungen, die mesenchymale Stammzellen enthalten. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Mikropipette, um 100 Mikroliter der behandelten und kontrollierbaren Makrophagenzellsuspensionen in die entsprechenden experimentellen Vertiefungen entsprechend dem Plattendesign zu geben und über Nacht wie demonstriert zu inkubieren. Saugen Sie das Medium vorsichtig aus dem vierwandigen Kammerobjektträger mit mesenchymalen Stammzellen ab.
Verwenden Sie eine Mikropipette, um 530 Mikroliter der Makrophagenzellsuspension entsprechend dem Design in die entsprechenden Vertiefungen zu geben und über Nacht zu inkubieren. Geben Sie einen Milliliter Lebendzell-Bildgebungsmedium in die Durchstechflasche mit einem Milligramm Zymosan-Partikeln und sammeln Sie die mittlere Partikelmischung in einem Glaskulturröhrchen. Nachdem Sie die Durchstechflasche mit einem zusätzlichen Milliliter Bildgebungslösung gespült haben, übertragen Sie das gespülte Bildgebungsmedium in das Glasröhrchen und fügen Sie dann drei Milliliter zusätzliche Bildgebungslösung hinzu, um 0,2 Milligramm pro Milliliter Zymosan-Partikelsuspension zu erhalten.
Wirbeln Sie die Zymosan-Suspension mit schnellen Impulsen für 30 bis 60 Sekunden und verwenden Sie dann einen Sondenschallgerät, um die Suspension mit 60 schnellen Impulsen zu beschallen. Nachdem Sie das Medium abgesaugt haben, spülen Sie die experimentellen Vertiefungen und Reagenz-Blankos mit 100 Mikrolitern Lebendzellbildgebungslösung ab. Als nächstes saugen Sie die Lebendzellbildgebungslösung aus den Vertiefungen ab und fügen Sie 100 Mikroliter der Zymosan-Suspension hinzu.
Öffnen Sie das Plattenfach des Fluoreszenzlesers über die Touchpad-Oberfläche. Stellen Sie den Teller ohne Deckel in das Fach mit dem A1-Well in der oberen linken Ecke. Schließen Sie das Fach mit dem Touchpad und klicken Sie auf die grüne Lesetaste im oberen Menü.
Um den Phagozytose-Assay durchzuführen, werden nach dem Spülen der ersten experimentellen Vertiefung mit 750 Mikrolitern des bildgebenden Mediums 400 Mikroliter der Zymosan-Suspension hinzugefügt, wobei die verbleibenden Vertiefungen im Wachstumsmedium verbleiben. Als nächstes legen Sie den Objektträger auf die inkubierte Stufe des Bildgebungssystems. Verwenden Sie die Imaging-Software.
Wählen Sie auf der Registerkarte Suchen die Option Hellfeld aus, und klicken Sie dann auf das Okularsymbol. Verwenden Sie das 10-fache Objektiv mit dem Okular und dem Fokussierknopf, um auf die Zellen zu fokussieren. Wählen Sie die Registerkarte Erfassung aus.
Öffnen Sie das Dropdown-Menü des Experiments und wählen Sie einen Satz von Wellenlängen aus, der einen EGFP-Filterset für 509 Nanometer Anregung und 533 Nanometer Emissionswellenlängen des pH-empfindlichen Farbstoffs enthält. Wenn noch etwa zwei Minuten auf dem Timer verbleiben, klicken Sie auf das 20X-Symbol im Objektivmenü, um das Objektiv in 20X zu ändern, klicken Sie dann auf das Kanalmenü, wählen Sie EGFP-Filter und stellen Sie im Belichtungsmenü die Belichtungszeit auf 400 Millisekunden ein, um den pH-empfindlichen grünen Fluorophor zu erkennen, und klicken Sie dann auf Live. Nachdem Sie den Fokus eingestellt haben, klicken Sie auf Stopp, um das Licht auszuschalten, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben der obersten Zeitraffer-Versuchseinstellung.
Wählen Sie im Menü "Fokussierstrategie" die Option "Software-Autofokus" und wählen Sie im Dropdown-Menü die Smart- und Core-Einstellungen aus, um die Zeit der Belichtung während der Ausführung des Autofokus zu verkürzen. Legen Sie im Zeitraffermenü die gewünschte Anzahl der Erfassungen auf 30 bis 60, die Intervallzeit auf eine Minute fest und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Experiment starten, um die Erfassung zu starten. Die Wirkung von Interferon gamma auf die Kokultur wurde untersucht.
Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Kokultur von Makrophagen mit mesenchymalen Stammzellen die phagozytische Aktivität des Makrophagen verstärkt. Die Interferon-Gamma-Behandlung reduziert die Aktivität des Makrophagen. In Gegenwart von mesenchymalen Stammzellen wurde die phagozytische Aktivität des Makrophagen jedoch teilweise gerettet.
Die optimalen Zelldichten sind in diesen Studien entscheidend. Und wenn die Makrophagenzellen mit einer zu niedrigen Dichte plattiert wurden, wurden Änderungen der Fluoreszenzintensität nicht nachgewiesen. Wenn die Makrophagenzellen mit einer hohen Dichte plattiert wurden, war die Fluoreszenzintensität in allen Gruppen schnell erhöht und Unterschiede wurden nicht erkannt.
Eines der wichtigsten Dinge bei diesem Verfahren ist es, sicherzustellen, dass die Zelldichten optimiert und zwischen den Experimenten konsistent gehalten werden.
