Das übergeordnete Ziel dieses Essays ist es, Makrophagen und opsonisierte rote Blutkörperchen für die Visualisierung der Phagozytose durch dreidimensionale Zeitraffermikroskopie vorzubereiten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, wie Phagozyten Partikel erfassen und aufnehmen. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung der Partikelaufnahme in Echtzeit, anders als bei herkömmlichen Endpunkt-Assays, die nur die Beurteilung ermöglichen, ob, aber nicht wie, ein Teilchen aufgenommen wurde.
Im Allgemeinen können Personen, die neu bei dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, bis sie sich an die Zellisolationsverfahren gewöhnen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir zum ersten Mal, als wir die Vorteile des Spinnens dieser konfokalen Mikroskopie für die 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Phagozytose erkannten. Um peritoneale Makrophagen zu isolieren, legen Sie einen 24 Gauge Plastikkatheter in das Peritoneum einer drei bis vier Monate alten Maus und verwenden Sie eine Kunststoff-Fünf-Milliliter-Spritze, um den Hohlraum zweimal mit 4,5 Millilitereis-kaltem HBSS ohne Kalzium und Magnesium pro Spüle zu spülen.
Übertragen der angesaugten Suspension in ein 14-Milliliter Polypropylen-Rundbodenrohr, wie es gesammelt wird. Wenn beide Proben geerntet wurden, zentrifugieren Sie das Aspirat und setzen Sie die Peritonealzellen in einem Milliliter vollständiger bikarbonatfreier RPMI 1640 Medium, um etwa sechs mal 10 bis sechs Milliliter Konzentration zu erreichen. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter komplettes HEPES-Ergänzungsmedium zu einem Reservoir eines fibronectin beschichteten Kanalschlittens hinzu, und neigen Sie den Schlitten, damit das Medium aus dem nachgeschalteten Reservoir angesaugt werden kann.
Um unerwünschte Luftblasen zu entfernen, fügen Sie einem der beiden Reservoirs ein bis zwei Milliliter frisches Medium hinzu und tragen Sie eine Reservoirkappe fest auf. Dann wenden Sie rhythmischen Daumendruck auf die Kappe an, um Luft aus dem Schlitten zu pumpen, und kippen Sie den Schlitten bei Bedarf. Wenn die gesamte Luft ausgestoßen wurde, neigen Sie den Schlitten in Richtung des ungekapselten Mediums, das Reservoir enthält, und entfernen Sie die Kappe, um zu vermeiden, dass Luft wieder in den Kanal gesaugt wird.
Nun pipette die Zelllösung ein paar Mal, um Klumpen zu reduzieren, und fügen Sie 100 Mikroliter der Zellen in einem Kanal der Rutsche für eine zweistündige Inkubation in einer feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius in Abwesenheit von Kohlendioxid. Am Ende der Inkubation ersetzen Sie das HEPES enthaltende Medium in jedem Schlitten mit komplettem Bicarbonat-ergänzungsmedium, wie gerade gezeigt. Dann legen Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius feuchten Inkubator mit 5% Kohlendioxid für ihre Nachtkultur.
Am nächsten Morgen einen Milliliter frisch erhaltenes gesundes Spenderblut in ein zwei Milliliter rundes Polypropylen-Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zentrifugieren Sie dann die Probe. Entfernen Sie das Plasma und das buffy Mantel mit Überstand.
Und übertragen Sie sorgfältig 100 Mikroliter der sedimentierten roten Blutkörperchen in ein zwei Milliliter Mircocentrifuge-Rohr mit 100 Mikroliter komplettem HEPES-Ergänzungsmedium. Beschriften Sie die Röhre 1:1 und übertragen Sie vier Mikroliter der verdünnten roten Blutkörperchen in ein neues Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit zwei Millilitern komplettem HEPES-Ergänzungsmedium. Dann beschriften Sie diese Röhre 4:2000 und legen Sie beide verdünnten roten Blutkörperchen Probenröhrchen auf Eis.
Um die peritonealen Makrophagen zu beschriften, ersetzen Sie das Bicarbonatmedium in jedem Kanalschlitten durch komplette Medien, die durch HEPES ergänzt werden. Dann kippen Sie den Schlitten, damit 100 Mikroliter der fluoreszierend markierten Maus Makrophagen spezifischen Antikörper von Interesse hinzugefügt werden tropfen weise auf die Öffnung des 100-Mikroliter-Kanal der Folie. Aspirieren Sie das Medium, das in das flussabwärts gelegene Reservoir fließt, und brüten Sie die Zellen für 20 Minuten in einer feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius in Abwesenheit von Kohlendioxid.
Während die Peritonealzellen beschriftet werden, mischen Sie 4:2000 rote Blutkörperchen Probe und übertragen 400 Mikroliter der Zellen in ein neues Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, in einem beheizten Aluminiumblock in einer laminaren Strömungshaube für etwa fünf bis acht Minuten. Wenn die Zellen auf 37 Grad Celsius erwärmt haben, mischen Sie 0,4 Mikroliter eines geeigneten roten fluoreszierenden Plasmamembranflecks mit den Zellen. Legen Sie die Zellen dann wieder in den Wärmeblock.
Nach fünf Minuten waschen Sie die Zellen, indem Sie 1,6 Milliliter frische HEPES hinzufügen, ergänzt komplettes Medium und Zentrifuge. Drehen Sie das Rohr, um das rote Blutkörperchen zu identifizieren. Mit einer bis 1,5 Milliliter Pipette Spitze vorsichtig entfernen Sie den Überstand in zwei Bänden, ohne das Pellet stören und mischen 2000 Mikroliter frische HEPES ergänzt komplette Medium mit den Zellen.
Zentrifugieren und wieder aufhängen das Pellet in 400 Mikroliter Medium. Dann beschriften Sie das Rohr PMS für Plasma Membranfleck. Am Ende der 20-minütigen Peritonealzellbeschriftung summieren Sie die Rutsche mit einem Milliliter frischer, kompletter HEPES-Ergänzungsmedium.
Zur Opsonisierung der roten Blutkörperchen fügen Sie einen Mikroliter Maus IGG2B monoklonalen Anti-Human-CD235A-Antikörper in die PMS-Proberöhre. Nach acht Minuten bei 37 Grad Celsius mit einmal pro Minute Mischen übertragen 100 Mikroliter der Plasmamembran gebeizt IGG opsonisierte menschliche rote Blutkörperchen auf die peritoneale Makrophagen enthaltenKanalgleiten. Sobald die menschlichen roten Blutkörperchen hinzugefügt wurden, montieren Sie das Dia auf einem sich drehenden Scheiben-Konfokalmikroskop.
Wenn der Bühneninkubator auf 37 Grad Celsius eingestellt ist und sofort mit der Abbildung der Zellen beginnt. Die Zeitraffer-3D-Bildgebung grüner fluoreszierender Makrophagen, die mit roten fluoreszierenden menschlichen roten Blutkörperchen präsentiert werden, ermöglicht die Visualisierung von phagozytären Ereignissen einzelner Teilchen. Zum Beispiel kann die Erfassung einer Maus IGG opsonisierte menschliche rote Blutkörperchen durch ein Makrophagen Filopodium beobachtet werden.
Ebenso wie das Quetschen einer menschlichen roten Blutzelle während der phagozytischen Tasse Bildung. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie peritoneale Makrophagen, fluoreszierend markierte Zellen und opsonisierte Partikel isolieren können.
