Zebrafische bieten ein wertvolles neuronales Regenerationsmodell, da sie sich von einer Rückenmarksverletzung erholen können. Diese Methode beschreibt die Schwimmausdauer und das Schwimmverhalten als Auslesungen der funktionellen Rückenmarksreparatur. Diese Technik bietet eine zuverlässige und quantifizierbare Beurteilung der Schwimmausdauer und des Schwimmverhaltens bei erwachsenen Zebrafischen.
Diese Methoden sind gleichermaßen anwendbar auf Studien der neuromuskulären und muskuloskelettalen Entwicklung, Erkrankung und Regeneration. Um die Schwimmausdauer zu beurteilen, öffnen Sie die Software zur Steuerung der Strömungsgeschwindigkeit. Klicken Sie auf das Kästchen Experiment und deaktivieren Sie Uswim und Uwater.
Ändern Sie dann die Strömungsgeschwindigkeit in der Uwater-Box unten links, um die Wasserströmungsgeschwindigkeiten anzupassen. Um ein automatisiertes Protokoll zu starten, klicken Sie auf das Feld Protokollierung starten. Wählen Sie im daraufhin geöffneten Dialogfenster in der Dropdown-Liste die Option Automatisiert aus.
Um eine zuvor gespeicherte Protokolldatei zu öffnen, klicken Sie auf das Dateisymbol neben der Protokolldatei. Richten Sie als Nächstes die Ausgabedatei ein, indem Sie auf das Dateisymbol neben der Protokolldatei klicken. Benennen Sie im sich öffnenden Datei-Explorer-Fenster die Ausgabedatei und speichern Sie sie am gewünschten Speicherort.
Richten Sie dann ein Split-Lap-Timer-Fenster ein, um den gleichzeitigen Zugriff auf die Flussgeschwindigkeitssteuerungssoftware und die Timerfenster auf dem Computerbildschirm sicherzustellen. Als nächstes richten Sie ein Fischsammelbecken ein, um die erschöpften Fische nach ihrer Entfernung aus dem Schwimmtunnel unterzubringen. Füllen Sie den Sammelbehälter und ein langes Polyvinylchloridröhrchen mit Wasser des Zebrafischsystems.
Legen Sie ein Ende des vorgefüllten Rohrs in den Sammelbehälter und ein weiteres in den Puffertank, um sicherzustellen, dass Wasser frei aus dem Puffertank in den Sammelbehälter fließen kann. Klemmen Sie das obere Ende des Rohrs mit einem Bindemittelclip ein, um den Wasserfluss zu verhindern, und verwenden Sie den Bindemittelclip, um den Wasserabfluss nach Bedarf zu steuern. Schließen Sie den Schwimmtunnel mit dem Schwimmausdauerdeckel, bevor Sie eine Gruppe von Fischen in den Schwimmtunnel legen.
Um die Fische an den Schwimmtunnel und die Strömungsrichtung zu gewöhnen, starten Sie den Split-Lap-Timer und stellen Sie die aktuelle Geschwindigkeit für die ersten fünf Minuten auf null Zentimeter pro Sekunde, für die nächsten fünf Minuten auf neun Zentimeter pro Sekunde und für die folgenden fünf Minuten auf 10 Zentimeter pro Sekunde ein. Öffnen Sie nach der Akklimatisierung das Protokoll und starten Sie das automatisierte Strömungsgeschwindigkeitssteuerungsprogramm, das die Wasserströmungsgeschwindigkeit jede Minute um zwei Zentimeter pro Sekunde erhöht. Überwachen Sie die Fische auf Erschöpfung.
Erschöpfte Fische werden in Richtung des hinteren Endes des Schwimmtunnels geschoben. Um sicherzustellen, dass ein Fisch erschöpft ist, tippen Sie vorsichtig auf das hintere Ende des Tunnels oder erzeugen Sie einen Schatten über diesem Bereich, um den Fisch zum Schwimmen anzuregen. Erschöpfte Fische reagierten nicht auf den Schreckreiz und lagen flach am hinteren Ende des Tunnels.
Wenn ein Fisch erschöpft ist, lösen Sie das Fischsammelrohr. Öffnen Sie das Fenster des Schwimmtunnels und sammeln Sie die Fische im Sammelbecken ein. Zeichnen Sie die Zeit bei Erschöpfung mit dem Split-Lap-Timer auf.
Nachdem alle Fische erschöpft und im Sammelbecken gesammelt sind, klicken Sie auf die Not-Aus-Taste in der Strömungsgeschwindigkeitskontrollsoftware und stoppen Sie den Timer. Um Filme für den Schwimmverhaltenstest aufzunehmen, platzieren Sie eine Gruppe von Fischen im Schwimmtunnel und schließen Sie den Tunnel mit einem standardmäßigen, vollständig geschlossenen Deckel. Öffnen Sie dann ein neues Aufzeichnungsfenster und benennen Sie die Datei.
Klicken Sie noch nicht auf Aufzeichnen. Bevor Sie ein neues Experiment beginnen, legen Sie ein Papiertuch oder ein Stück Stoff auf die Seite des Schwimmtunnels, um sicherzustellen, dass alle Verhaltensweisen auf das Schwimmen von Fischen zurückzuführen sind und nicht auf eine Schreckreaktion, die durch Bewegung in der Umgebung verursacht wird. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass das Wasser ruhig ist und sich keine Wellen über den Rahmen bewegen, klicken Sie im Fenster der Kamerasoftware auf Aufnahme, um die Aufnahme der Filmdatei zu starten.
Klicken Sie dann in der Flussgeschwindigkeitssteuerungssoftware auf Start, um das Protokoll zu starten, das ohne Unterbrechung fortgesetzt wird. Sehen Sie sich den Film an, um sicherzustellen, dass keine Bilder fallen gelassen werden, es keine Blasen im Sichtfeld gibt und alle Fische aufgezeichnet werden. Sobald die Filmaufnahme abgeschlossen ist, klicken Sie auf Not-Aus, um das Flussgeschwindigkeitssteuerungsprotokoll zu beenden und zu überprüfen, ob die Datenausgabedatei automatisch gespeichert wird.
Schließen Sie dann das Aufnahmefenster, um die Filmdatei zu speichern. Entfernen Sie nach der Aufnahme den Deckel. Holen Sie die Fische vorsichtig und bringen Sie sie in ihr Aquarium zurück.
Um die aufgenommenen Filme zu analysieren, öffnen Sie die tracking_v2. ijm-Skript in Fidschi und klicken Sie auf Ausführen, um das Programm zu starten. Wählen Sie im Popup-Fenster den Ordner aus, der die zu verfolgenden Schwimmverhaltensfilme enthält, und klicken Sie auf Öffnen.
Suchen Sie nach Frame eins des ersten Films, einem Dialogfeld und dem Region-of-Interest oder ROI-Manager, der angezeigt wird. Folgen Sie den Anweisungen im Dialogfeld und erstellen Sie einen ROI am Boden der Schwimmtunnelkammer. Klicken Sie dann auf OK und stellen Sie sicher, dass keine schwarzen Ecken zu sehen sind.
Das Schwellenwertfenster wird zusammen mit einem bearbeiteten Schwellenwert-Frame geöffnet. Ändern Sie das Farbschema von Schwarz-Weiß zu Rot und passen Sie den maximalen Wert an, bis der erste Rahmen nur den Fisch in Rot und sonst nichts zeigt. Notieren Sie den Schwellenwert und klicken Sie im Dialogfeld auf OK.
Öffnen Sie die SwimBehavior_v7-3, um deskriptive Statistiken auszurichten, zusammenzustellen und zu erfassen. R-Skript in RStudio und klicken Sie auf Quelle in der oberen rechten Ecke des Skriptabschnitts. Wählen Sie in einem neuen Fenster, das geöffnet wird, den Ordner aus, der die _raw enthält.
CSV-Dateien, die von Fidschi generiert wurden, und klicken Sie auf Öffnen. Das Programm wird automatisch ausgeführt. Bestätigen Sie im Popup-Dialogfeld die Anzahl der Fische in jedem Film.
Klicken Sie auf Ja, wenn die angegebenen Zahlen korrekt sind, oder auf Nein, wenn die Zahlen falsch sind. Sobald die Dateien ausgerichtet sind, suchen Sie nach einer neu generierten _aligned. CSV-Datei.
Nachdem Sie sichergestellt haben, dass das Programm die Daten kombiniert, Statistiken ausführt und Ausgabediagramme plottet, suchen Sie nach den Analysedateien, die in einem neuen Ordner mit der Bezeichnung Ergebnisse im übergeordneten Ordner generiert wurden, der die _raw enthält. csv und _aligned. CSV-Dateien.
Die Schwimmausdauer, die nach zwei, vier und sechs Wochen nach der Verletzung beurteilt wurde, zeigte nach zwei Wochen einen Verlust von 60% der Schwimmausdauerkapazität. Die regenerierenden Fische gewannen vier und sechs Wochen nach der Verletzung allmählich wieder an Schwimmausdauer. Im Schwimmverhaltensassay schwammen die Kontrollen stetig im vorderen Teil der Schwimmtunnelkammer, was einer erhöhten Y-Position entspricht.
Im Gegensatz dazu konnten verletzte Fische zwei Wochen nach der Verletzung keine konstante Schwimmkapazität gegen die Strömung aufrechterhalten. Folglich sind ihre Schwimmbahnen unregelmäßiger, mit einer allgemeinen Abnahme der Y-Position. Die Y-Position stieg vier und sechs Wochen nach der Verletzung, was darauf hindeutet, dass regenerierende Tiere allmählich ihre Fähigkeit zum Schwimmen wiedererlangten.
Darüber hinaus waren läsionierte Tiere in zwei Wochen nach der Verletzung im Vergleich zu unverletzten Kontrollen deutlich weniger aktiv, wurden im hinteren Quadranten des Schwimmtunnels zum Stillstand gebracht und verloren ihre Fähigkeit, gegen niedrige Strömungsgeschwindigkeiten zu schwimmen. Im Einklang mit ihrer angeborenen Fähigkeit, eine funktionelle Genesung zu erreichen, normalisierten die läsionierten Tiere allmählich die Parameter des Schwimmverhaltens vier und sechs Wochen nach der Verletzung. Die Verwendung der Fließgeschwindigkeitsregelungssoftware in diesem Protokoll ist optional.
Die Alternative besteht darin, den Wasserströmungsmotor manuell zu steuern. Die in dieser Studie beschriebenen Assays können verwendet werden, um auf neurale, muskuläre oder skelettale Phänotypen vorzuscreenen. Das interessierende Gewebe kann dann für die histologische oder molekulare Untersuchung entnommen werden.
Unser Labor und andere haben dieses Protokoll verwendet, um Gene zu identifizieren, die für die angeborene neuronale Reparatur benötigt werden, und Faktoren, die ausreichen, um die neuronale Regeneration zu verbessern.
