Weil Bakterien so klein sind, vergessen die Menschen oft, dass sie dreidimensionale Objekte sind. Unser Protokoll ermöglicht die genaue Rekonstruktion der Formen von flachen und gekrümmten Zellen. Dieses Protokoll erfordert nur geringfügige Änderungen an einem Standardmikroskop und sie sind in MATLAB-Skripten leicht verfügbar.
Vor Beginn des Experiments legen Sie zwei Stapel von je drei 20 mal 20 Millimeter Abdeckung rutscht auf die gegenüberliegenden Enden eines einzelnen Glasmikroskop-Dias. Pipette 200 Mikroliter Agarose Pad Lösung auf dem Schlitten und sofort und fest legen eine zweite Rutsche auf den Stapel von Abdeckung rutscht, um die Agarose abzuflachen. Nachdem die Agarose bei Raumtemperatur etwa eine Minute lang erstarrt ist, schieben Sie vorsichtig vom oberen Schlitten ab und verwenden Sie ein großes Ende einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um einzelne Pads mit fünf Millimeterdurchmessern aus dem Gel zu schneiden.
Wenn alle Pads erhalten wurden Pipette die E.coli-Zellkultur mehrmals, um alle Zellklumpen zu stören und um sicherzustellen, dass die Zellen homogen verteilt werden, bevor ein Mikroliter Subkultur auf jedem Pad hinzugefügt. Nachdem die Proben fünf bis zehn Minuten lufttrocken getropft wurden, bestätigen Sie, dass die Tröpfchen vollständig in die Pads aufgenommen wurden, bevor sie einen Deckelaufschub auf die Pads legen. Dann verwenden Sie einen Wattestäbchen, um sanft ein geeignetes Dichtmittel um den Rand des Deckels schlupf zu bürsten, wobei darauf geachtet wird, dass das Dichtmittel von der Oberseite des Deckels wegbleibt.
Unmittelbar nach dem Abdichten des Deckelschlupfes legen Sie den Schlitten auf eine Mikroskopstufe und nach fünf Minuten thermischem Gleichgewicht verwenden Sie die Mikroskopfokusräder, um die Mitte einer Zelle in den Fokus zu rücken. Aktivieren Sie in der zugehörigen Mikroskopsoftware unter ND-Erfassung das Feld Z, um einen Z-Stack zu erhalten, und klicken Sie auf die Home-Schaltfläche, um die Mitte der Zelle als Ausgangspunkt festzulegen. Stellen Sie die Schrittgröße auf 0,1 Mikrometer und die Reichweite auf vier Mikrometer ein, und stellen Sie sicher, dass das Z-Gerät auf die Piezo-Stufe eingestellt ist.
Es ist wichtig, dass es eine ausreichende Unschärfe sowohl am oberen als auch am unteren Rand der Zelle gibt, so dass die Zelle fast nicht vom Hintergrund zu unterscheiden ist. Stellen Sie die fluoreszierenden Kanäle unter dem Lambdafenster auf die Einstellungen für die abgebildeten fluoreszierenden Moleküle ein und bestätigen Sie, dass die Reihenfolge des Experiments auf Lambda festgelegt ist, sodass vor dem Wechsel ein vollständiger Z-Stack in jedem Farbkanal erhalten wird. Klicken Sie dann auf Jetzt ausführen, um mit der Bildaufnahme zu beginnen.
Wenn alle Bilder erfasst wurden, öffnen Sie die Dateien in einem entsprechenden Bildanalyse-Softwareprogramm. Zeichnen Sie ein Kästchen um eine einzelne Zelle, und duplizieren Sie diese Zelle zweimal, einmal für jeden Kanal, um sicherzustellen, dass das Kontrollkästchen Hyperstack doppelt aktiviert ist, und ändern Sie den Kanal in ein oder zwei. Sobald beide Stacks verfügbar sind, wählen Sie Bilder, Stapel, Werkzeuge und Concatenate aus, um die Bilder zu kombinieren.
Mit dem Proteinkanal zuerst und dem Formkanal zweite. Nach dem Speichern des neuen Bildes als TIFF-Datei erstellen Sie einen Ordner in einem Ordner auf dem Desktop, der die zugeschnittenen Bilder und die cell_shape_settings_tri enthält. txt-Datei aus shae-cellshape-public exampleData_tri.
Bearbeiten Sie die cell_shape_settings_tri. txt-Datei, um die richtigen Einstellungen für das Experiment von Interesse zu haben. Führen Sie die Cell_shape_detector3dConvTriFolder-Funktion mit der Zeichenfolge an den Ordnerspeicherort gefolgt von der Nummer der Zelle aus, in der gestartet werden soll, und der Anzahl der Zellen, die ausgeführt werden sollen.
Um zu bestätigen, dass die Zellen ordnungsgemäß rekonstruiert wurden, führen Sie ScreenFits aus. Wenn die grafische Benutzeroberfläche geöffnet wird, klicken Sie auf die Schaltfläche Ordner auswählen und wählen Sie den Ordner mit den Rekonstruktionsdatendateien aus, um die einzelnen Zellenrekonstruktionen visuell zu überprüfen. Wählen Sie für jede Zelle, die falsch geformt erscheint oder die keine vollständige Abdeckung hat, das Feld neben der Rekonstruktion aus, um FLAG an den Namen anzuhängen, damit sie von jeder nachgelagerten Analyse ausgeschlossen werden kann.
Führen Sie anreicherungSmothingSpline aus, um ein Anreicherungsprofil der relativen Konzentration des Proteins von Interesse in Abhängigkeit von der Gaußschen Krümmung an der Oberfläche zu erstellen. Wählen Sie dann jeden Ordner mit dem gerade erstellten TRI aus. und wählen Sie die neu erstellte Kurvenmattendatei aus.
Diese Methode ist besonders nützlich, wenn gekrümmte oder ungewöhnlich geformte Zellen als 2D-Darstellung die Krümmung der Zellen nicht genau reflektieren können. In diesem Experiment wurde ein grünes fluoreszierendes Fusionsprotein zum bakteriellen Aktinprotein MreB erzeugt, um die genaue Lokalisation des Actinproteins sowohl in wilden Typ- als auch in mutierten E.coli-Zellen zu untersuchen. Durch diese Messungen in 3D-aufgenommenen Bildern konnten die Formen sowohl der Wilden typals als auch der RodZ-Mutantenzellen rekonstruiert werden.
Die Lokalisierung von MreB wurde dann bestimmt, um an kleinen Gaußschen Krümmungen angereichert zu werden, ein geometrisches Merkmal, das nur in 3D in einer rodZ abhängigen Weise gemessen werden kann. Denken Sie daran, sicherzustellen, dass der Z-Stack groß genug ist, dass die Zellen oben und unten verschwommen sind und dass die Zellen gut voneinander entfernt sind. Wir zeigen, wie die geometrische Lokalisierung von Proteinen in 3D gemessen werden kann, aber aus diesen Daten können andere Informationen berechnet werden, wie z. B. die Größe von Tag-Protein-Baugruppen.
