Name: surgical procedures and methodology for a preclinical murine model of de novo mammary cancer metastasis
Uploaded: 2017-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
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Die Autoren danken Jo Hill für die histopathologische Hilfe, Dr. John Gleysteen für den Unterricht in der chirurgischen Technik, Tessa Diebel für Videographie-Hilfe, alle Mitglieder der Wong- und Coussens-Labore für kritische Einblicke und Diskussionen und das OHSU Knight Cancer Institute für finanzielle Unterstützung. Die Autoren bestätigen die Unterstützung von T32GM071388-10 und T32CA106195-11 an CEG, das NCI / NIH, das Department of Defense Breast Cancer Research Program, die Susan G Komen Foundation, die Breast Cancer Research Foundation und eine Stand Up To Cancer - Lustgarten Foundation Pankreas-Krebs-Konvergenz-Traumteam Translationsforschungsstipendium (SU2C-AACR-DT14-14) an LMC, ein Frauengesundheitskreis der Stiftungspreis an MHW und das Brenden-Colson-Zentrum für Pankreasgesundheit an MHW und LMC.

Tiere, die in dem folgenden Protokoll verwendet werden, werden vom Oregon Health &amp; Science University&#39;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) abgedeckt, das so konzipiert ist, dass es mit dem Tierschutzgesetz und dem Public Health Service (PHS) -Politik übereinstimmt. Aufrechterhaltung der sterilen Bedingungen: Sterilisierte Instrumente sollten verwendet werden und zwischen Mäusen, sollte mit steriler Gaze abgewischt werden, in PBS gespült, gefolgt von Sterilisation mit Desinfektionsmittel 70% Ethanol für mindestens 15 Minuten. Eine chirurgische Kappe, Gesichtsmaske, Kleid und Handschuhe sollten für Überlebensoperationen getragen werden. Die präoperative Vorbereitung des Tieres für Überlebensoperationen ist in dem folgenden Protokoll enthalten. Siehe Tabelle 1 für eine Liste von Reagenzien und Geräten. 1. Isolierung und Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus primären Mamma-Tumoren <ol><li> Anästhesieren Sie Spender weibliche 100 Tage alte transgene MMTV-PyMT (FVB / n) Mäuse und pflegen unter cKontinuierliche Sedierung durch Verabreichung von 2% Isofluran über eine Anästhesiemaske. Vergewissern Sie sich, dass die Maus mit einem abwesenden Fußrastenreflex richtig betäubt wird. </li><li> In einer sterilen Umgebung resezieren primäre Mamma-Tumoren von 100-Tage alten transgenen weiblichen MMTV-PyMT (FVB / n) Mäusen durch Trennen des Brusttumors von der darüber liegenden Haut und dem umgebenden Fettgewebe und / oder Lymphknoten mit steriler Schere. Euthanisieren der anästhesierten Mäuse durch zervikale Versetzung. </li><li> Mit sterilen Scheren oder einem Skalpell, primäre Primärtumoren manuell in kleine Stücke (~ 1,0 mm 3 ). Platzieren Sie Tumorstücke in 3,0 mg / ml Kollagenase A und 4,0 U / ml DNase I, gelöst in DMEM. Verwenden Sie ~ 10 ml des oben genannten Verdauungsmediums pro 1,0 cm Durchmesser Tumor. <ol><li> Führen Sie die Verdauung in einer sterilen 25 ml-Flasche mit einem sterilen Rührstab bei ~ 125 U / min und 37 ° C für 40 min. </li></ol></li><li> Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von fötalem Rinderserum (FBS) zu einer Endverdünnung von 10% und legen Sie die gesamte Mischung auf wEt ice wo es beibehalten wird. </li><li> Filtriere die verdaute Tumorsuspension durch ein 0,7 μm Nylon-Sieb in ein 50 mL konisches Röhrchen und verwirre jeden im Sieb verbleibenden Tumor. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 300 xg bei 4 ° C. </li><li> Das Pellet in 10 ml DMEM pro 1,0 cm Tumor resuspendieren und durch ein 0,7 μm Nylon-Sieb filtrieren. Zählzellkonzentration, dann bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren. </li><li> Pellet in 10% Dimethylsulfoxid mit 90% FBS in einer Konzentration von 2 x 10 7 lebenden Zellen / ml resuspendieren. Spezielle Suspensionen des ganzen Primärtumors bei -80 ° C aufbewahren. </li></ol> 2. Orthotopische Injektion von Mamma-Tumor <ol><li> Teilweise aufgetaute gefrorene primäre Tumorsuspensionen bei 37 ° C, bis das gefrorene Pellet aus dem Kryogenrohr in 20 mL DMEM freigesetzt werden kann und die Zellen zählt. Bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren und Zellen in einem 1: 1 DMEM resuspendieren: Wachstumsfaktor-reduzierte solubilisierte Basalmembranpräparation eXtrahiert aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkom bei einer Konzentration von 1 x 10 7 Zellen / ml (siehe Tabelle der Materialien ). </li><li> Legen Sie die anästhesierte Empfänger weibliche syngene Maus ventrale Seite nach oben und pflegen unter kontinuierlichen Sedierung durch die Verabreichung von 2% Isofluran über eine Anästhesie-Maske. </li><li> Sterilisieren Sie die rechte 4. Brustdrüsen-Injektionsstelle mit aerosolisiertem 70% Ethanol und applizieren Poly (vinylpyrrolidon) -Iod mit einem sterilen Wattestäbchen. </li><li> 100 μl (1 x 10 6 lebende Zellen aus gefrorenen primären Tumorsuspensionen) in die ungekürzte rechte 4. Brustdrüse der 6 bis 10 Wochen alten weiblichen FVB / n-Maus mit einer 29 g 0,3 mL Insulinspritze injizieren. </li></ol> 3. Chirurgische Resektion des Orthotopischen Mamma-Tumors <ol><li> 38-60 Tage nach der Tumorzellinjektion, Euthanisierungsmäuse, die keine orthotopen Tumorvolumina im Bereich von 172 bis 450 mm 3 Volumen aufweisen (Länge x (Breite 2) </Sup&gt;) / 2] (etwa 75% der injizierten Mäuse). </li><li> Legen Sie anästhesierte Mäuse, die die richtige Tumorgröße ventral nach oben unter kontinuierlicher Sedierung durch Verabreichung von 2% Isofluran über eine Anästhesiemaske und bestätigen Sie, dass die Maus korrekt mit einem abwesenden Fußquetschreflex betäubt wird. Tragen Sie Tierarzneimittel auf die Augen zur Verhinderung der Trockenheit, während unter Sedierung. </li><li> Spray 70% Ethanol zur Sterilisation der chirurgischen Bereich um den primären Tumor, dann wenden Poly (vinylpyrrolidon) -Iod mit einem sterilen Wattestäbchen. HINWEIS: Die Haarentfernung an der chirurgischen Stelle führte zu Hautausschnitten und / oder Infektionen für ~ 5% Mäuse und wurde daher von diesem Schritt ausgeschlossen (Daten nicht gezeigt). </li><li> Wie in Abbildung 1C gezeigt , machen Sie einen anfänglichen Hautschnitt mit stumpfen Scheren medial-kaudal zum Tumor. </li><li> Als nächstes machen Sie eine überlegene Exzision der Haut ( Abbildung 1C ) medial zum Tumor. Achten Sie auf die Notwendigkeit, jede Vaskulatur fe zu kauterisierenDen auf der Haut befindlichen Tumor vor dem Ausbau des Einschnitts. </li><li> Setzen Sie den Hautschnitt seitlich fort (hinter dem Tumor), dann machen Sie eine überlegene Hautexzision (lateral to tumor) und mediale Exzision (überlegen zum Tumor) ( Abbildung 1C ). </li><li> Nachdem die Haut in Umfangsrichtung um den Tumor herausgeschnitten worden ist ( Abbildung 1C ), heben Sie die überliegende Haut an den Tumor mit Pinzette, während stumpfes Sezieren der Tumor weg von der Bauchwand Muskulatur und halten die Brustdrüsen intakt. </li><li> Identifizieren (durch stumpfes Präparieren) und große Gefäße kauterisieren Laufen durch die 4. und 5. Brustdrüsen. </li><li> Verbrauch etwa die Hälfte der 4. und 5. Brustdrüsen am Kauterisation Ort des Tumors zu befreien, darüber liegende Haut und Segmente der Brustdrüsen (1C). </li><li> Im Falle von Blutungen, identifizieren aktiv BlutungenSchiffe und sofort kauterisieren. Wenn mehr als 250 μl Blut verloren gehen, schließen Sie die Maus aus dem Studium und euthanisieren Sie es. </li><li> Schließen Sie Exzisionsstellen mit Wundklammern mit einem Wundklammerapplikator ( Abbildung 1C ). HINWEIS: Entfernen Sie die Wundclips 10 Tage nach der Operation mit einem Wundclip-Entferner. </li><li> Verabreichung von warmer steriler Kochsalzlösung subkutan (4% des Körpergewichts des Tieres) und halten das Tier mit einer Wärmelampe warm. Überprüfe die Tiere alle 5-10 Minuten bei der Erholung von der Anästhesie. HINWEIS: Die Verabreichung von entweder Bupivacain oder Lidocain erhöhte die postoperative Mortalität (Daten nicht gezeigt). Mäuse, die Anzeichen von Schmerzen zeigten (Knicken, unfreiwillig zu bewegen, Bruchlosigkeit) 1 h nach der Operation wurden euthanasiert. <ol><li> Sobald die Maus vollständig erholt ist, bringen Sie sie an die Gesellschaft anderer Mäuse zurück. </li></ol></li></ol> 4. Isolierung und Verarbeitung von Blut und Lunge für Durchflusszytometrie und Histologie &lt;Ol&gt; <li> Bei den Studienendpunkten sollten Mäuse auf verschiedene histopathologische Untersuchungen vorbereitet werden. 90 min vor der Euthanasie geben jeder Maus eine intraperitoneale Injektion von Bromodeoxyuridin (BrdU, 50 μg / g Mausgewicht) bei einer Konzentration von 6,25 μg / μL in 1x PBS. ANMERKUNG: Gefrorene Bestandteile von gelöstem Bromodeoxyuridin werden innerhalb von 1 Monat nach der Herstellung verwendet. </li><li> 10 min vor der Euthanasie, mit der Maus anästhesiert, sammeln Sie retroorbitales Blut (&gt; 500 μl) unter Verwendung von heparinisierten Kapillarröhrchen und übertragen anschließend auf Röhrchen, die mit Dipottium-EDTA auf Eis gehalten wurden. </li><li> Zum Entfernen von Lungen und restlichen Brustgewebe, bilden einen Mittellinienschnitt mit einer Schere aus dem Unterleib zu der Mündung der Brust- und Bauchhöhle (2A) zu exponieren, und schälen sich seitlich um die Haut freizulegen , auch die verbleibenden rechten 4. und 5. Brust Drüsen </li><li> Das verbleibende Brustdrüsengewebe verbrauchen und untersuchenUm das primäre Tumor-Nachwachsen auszuschließen, indem man das mit dem Serum beschichtete Formalin-fixierte Paraffin-eingebettete (FFPE) Gewebe durch Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) -Färbung ( ergänzende Abbildung 1 ) bewertet . </li><li> Um die Lunge zu entfernen, öffne die Bauchwand mit einer Schere zum Zwerchfell, dann test du das Tier, indem du die Bauchaorta abschneide, um Blut vor der Perfusion der Lungen abzulassen ( Abb. 2B -2C ). </li><li> Schneiden Sie das Zwerchfell entlang der Brustkorb aus einer Bauch-Ansatz, um sicherzustellen, dass die Lunge und Herz zu vermeiden. Dann den Thorax durch Schneiden durch die seitlichen Seiten des Brustkorbes aussetzen ( Abbildung 2D ). </li><li> Unter Verwendung einer 23-Gauge-Nadel auf einer 20-ml-Spritze, perfuse Lungen mit ~ 5,0 mL DPBS (~ 10 ml / min) durch den rechten Ventrikel des Herzens, bis die Lungen ganz weiß sind ( Abbildung 2E -2F ). Sofort schneiden Sie das Herz von der Hauptvesse abIst das Blut nicht wieder in die Lunge. </li><li> Damit das Lungengewebe für histopathologische Untersuchungen fixiert und verarbeitet werden kann, injizieren Sie ~ 1,0 ml 10% Formalin bei 4 ° C in die exponierte Trachea-Abschrägungsseite in Richtung der Lunge mit einer 23-Gauge-Nadel ( Abbildung 2G- 2H ). Setzen Sie die Einspritzung ein, sobald die Lungen vollständig ausgedehnt und mit Fixiermittel gefüllt sind ( Abbildung 2I ). </li><li> Lungen-Lungen-Lappen aus der Trachea und Emersions-Lungengewebe in neutral-gepuffertem Formalin für die anschließende Paraffin-Einbettung oder OCT-Gefriermedium pro Standard-histopathologischen Verfahren. </li><li> Quantifizierung der metastatischen Belastung in den Lungen durch serielle Abschnitte von FFPE-Lungengewebe und Auswertung von Mikrotomabschnitten (100 μm, dreizehn Abschnitte) durch H &amp; E-Färbung ( Abbildung 1B ). </li></ol>

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Die Autoren haben keine Offenlegung von Konflikten mit den hier dargestellten Daten.

Änderungen und Fehlersuche: Wenn der stumpfe Sezierungs-Tumor von der Bauchwand entfernt ist, kann der Tumor an der Bauchwand haften bleiben. Dies wurde bei &lt;5% der mit Tumoren injizierten Mäuse beobachtet (Daten nicht gezeigt). Für Mäuse mit an der Bauchwand anhaftenden Tumoren sollte die Maus euthanasiert werden, da die Resektion ohne primärem Tumorwachstum schwierig ist. Einschränkungen von Modell / Technik: <p cl...

Frauen in Nordamerika haben ein ~ 12% lebenslanges Risiko der Entwicklung von Brustkrebs 2 ; Eine Mehrheit dieser Personen wird primäre Tumore über die Operation entfernt haben, und je nach Krebs Subtyp, wird dann erhalten gezielte, endokrine, Chemo- und / oder Strahlentherapie in der adjuvanten Einstellung 3 . Beispiele umfassen, mit Hormonrezeptor-positiven Tumoren diagnostizierten Frauen HER2-zielgerichteten Therapien mit Bestrahlung / Chemotherapie, während keine zielgerichteten Therapien noch verfügbar sind für triple negative Tumoren 3 Empfangen anti-Östrogen - Therapien und Frauen mit HER2-positiven Tumoren erhalten. Trotz Fortschritten in der Strahlung, Chemotherapie, personalisierte und Hormon-basierte Therapien, die chirurgische Resektion ergänzen, wiederholt sich die Krankheit bei 30-70% der Frauen, die mit der Stufe II oder III-Krankheit 4 diagnostiziert wurden, da Therapien bei der Beseitigung der metastatischen Erkrankung in entfernten Organen weitgehend unwirksam sind Lunge, Knochen, bRegen und / oder Leber 5 . Dies ist besonders bedeutsam, da bei der Metastasierung in Abwesenheit eines primären Tumorwachstums dies impliziert, dass disseminierte maligne Zellen wahrscheinlich bereits in sekundären Organen zum Zeitpunkt der endgültigen Operation vorhanden waren. So sind dringend Therapien erforderlich, um das Wachstum von metastatischen Tumoren zu beseitigen oder zu verlangsamen. Während de novo Mausmodelle der Brustkarzinogenese bemerkenswert informativ bei der Aufdeckung von Mechanismen zur Regulierung der neoplastischen Progression 1 sind , haben bestehende Modelle auch mehrere Einschränkungen. Eines davon ist die Tatsache, dass de novo transgene Modelle typischerweise Primärtumore in multiplen Brustdrüsen entwickeln, wobei die primäre Tumorbelastung die Dauer der Studien begrenzt. Während primäre Tumorzell-Flucht und metastatische Seeding wahrscheinlich früh in der neoplastischen Progression in diesen Modellen auftreten, entsteht eine offene Entwicklung von metastatischen Tumoren spät, und je nach oN der Maus Modell und Belastung Hintergrund, ist oft teilweise durchdringend 1 . Dies begrenzt den Nutzen der de novo- Modelle zur Entdeckung von Molekülen, die die Metastasierung in sekundären Organen regulieren, und zur Bewertung der präklinischen Wirksamkeit von Therapeutika in der adjuvanten Umgebung. Um diese Einschränkungen zu umgehen, entwickelten wir ein de novo autochthones Modell der Mamma-Karzinom-Metastase in die Lunge. Parentale transgene Weibchen ( dh MMTV-PyMT auf dem FVB / n-Stammhintergrund für hierin beschriebene Studien), die Spätstadium de novo Mamma-Tumoren tragen, sind bis zu 100 Tage 6 gealtert, wobei zu diesem Zeitpunkt ihre primären Tumoren chirurgisch reseziert und enzymatisch dissoziiert werden Einzelzelle Suspensionen. Suspensionen (1 x 10 6 Zellen) werden wiederum orthotopisch in 6-7-wöchige Empfänger-syngene weibliche Mäuse explantiert, wo sich einzelne primäre Mamma-Tumoren über einen Zeitraum von 38 bis 60 Tagen entwickeln ( 3 ) werden Empfängermäuse anästhesiert und Primärtumoren werden chirurgisch reseziert, so dass das Tumorwachstum an der chirurgischen Stelle minimiert wird, im Einklang mit der Operation bei Frauen ( Ergänzende Abbildung 1 ). Auf dem FVB / n-Stamm-Hintergrund entwickeln Mäuse histologisch nachweisbare metastatische Herde in der Lunge mit 45% Penetrance um ~ 115 Tage nach der Operation ( Abbildung 1B ). Mit dieser verlängerten Latenz des metastatischen Tumorwachstums ist das Modell eindeutig für die adjuvante Therapieabgabe positioniert und zur Aufklärung und Bewertung der zugrunde liegenden Biologie, die die metastatische Progression nach chirurgischer Entfernung von Primärtumoren beeinflusst.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>N/A</td><td>Prescription order</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pyrex bottle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS139525</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Bio&amp;nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0.7 &amp;micro;m nylon strainer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Growth factor-reduced Matrigel&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td>Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma</td></tr><tr><td>Poly(vinylpyrrolidone)&amp;ndash;Iodine complex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>29 gauge 0.3 mL insulin syringe</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>Small Vessel Cauterizer Kit</td><td>FST</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wound clips</td><td>Texas Scientific</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wound clip applier&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip wound clip remover&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine</td><td>Roche</td><td>10280879</td><td></td></tr><tr><td>Heparinized capillary tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer tubes with dipotassium EDTA&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 mL syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>OCT-freezing medium&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608930</td><td></td></tr><tr><td>Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)</td><td>Fisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>23g needle</td><td>Fisher</td><td>14-826-6B</td><td></td></tr><tr><td>FVB/n mouse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>001800</td><td></td></tr></tbody></table>

surgical procedures and methodology for a preclinical murine model of de novo mammary cancer metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Größer als 75% der Empfängermäuse, die 1 x 10 6 Zellen aus primären Mamma-Tumoren erhalten, die von MMTV-PyMT-Mäusen abgeleitet sind, entwickeln einzelne Mamma-Adenokarzinome im Bereich von 172 bis 450 mm 3 innerhalb von 38-60 Tagen (Daten nicht gezeigt). Mäuse, die für eine Randomisierung in Frage kommen, werden dann nach der chirurgischen Resektion von Primärtumoren in die Studiengruppen eingeschrieben ( Abbildung 1C ). Prim?...

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Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Präklinische Modelle, die eine adjuvante Therapie mit Brustkrebs-Metastase auswerten, fehlen. Um dies zu lösen, entwickelten wir ein murines Modell der de novo pulmonalen Mamma-Adenokarzinom-Metastase, wobei Therapien, die in der adjuvanten Einstellung (postchirurgische Resektion von Primärtumoren) verabreicht werden, auf die Wirksamkeit bei der Auswirkung von zuvor gesäten pulmonalen Metastasen untersucht werden können.

Chirurgische Verfahren und Methodik für ein präklinisches Murine - Modell von<em&gt; De Novo</em&gt; Mamma Krebs Metastase

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

13.8K Aufrufe.  Oregon Health & Science University.  Präklinische Modelle, die eine adjuvante Therapie mit Brustkrebs-Metastase auswerten, fehlen. Um dies zu lösen, entwickelten wir ein murines Modell der de novo pulmonalen Mamma-Adenokarzinom-Metastase, wobei Therapien, die in der adjuvanten Einstellung (postchirurgische Resektion von Primärtumoren) verabreicht werden, auf die Wirksamkeit bei der Auswirkung von zuvor gesäten pulmonalen Metastasen untersucht werden können. 

Serie: Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Ein Portal Veneninjektion Modell zur Untersuchung der Leber Metastasierung von Brustkrebs

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Forschung

Krebsforschung

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Orthotopen Injektion von Brustkrebs-Zellen in den Mäusen Mamma Fettlappen

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

Murine Modell der metastasierenden Lebertumoren in der Einstellung der Ischämie Reperfusionsverletzung

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

Modellierung von Hirnmetastasen durch intrakranielle Injektion und Magnetresonanztomographie

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Medizin

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

Einer präklinischen Mausmodell der Lebermetastasen

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

Ein orthotopen Mausmodell des Spontan Metastasierung von Brustkrebs

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

Generieren eines murinen orthotopen metastasierendem Brustkrebs Krebs Modells und Durchführung von murinen radikale Mastektomie

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

Chirurgische Verfahren und Methodik für ein präklinisches Murine - Modell von

Zusammenfassung

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