Dieses Protokoll ist eine Verschmelzung verschiedener Techniken, die es den Forschern ermöglichen würden, die Rolle des Kandidatengens in der Melanozytenbiologie abzugrenzen. Es ist ein ganzheitlicher Ansatz, um eine logische Schlussfolgerung zu erzielen. Durch die Kombination verschiedener Methoden können Störfaktoren vermieden werden und es kann den Forschern helfen, ein substanzielles Ergebnis zu erzielen.
Um mit der Analyse zu beginnen, immobilisieren Sie die 48 HPF-Embryonen mit 0,016% Tricain. Montieren Sie die Embryonen mit einigen Millilitern 1,5 bis 2% Methylcellulose in einer Petrischale. Nehmen Sie die Embryonen mit einer Pasteur-Pipette und legen Sie sie in Methylzellulose, um die Bewegung während der Bildgebung einzuschränken.
Für eine optimale laterale oder dorsale Bildgebung passen Sie ihre Position mit einer mehr als 5-fachen Vergrößerung an. Stellen Sie die Petrischale unter das Mikroskop. Stellen Sie den Fisch mit einem Manipulator so ein, dass alle fünf embryonalen Melanozytenstreifen gleichzeitig sichtbar sind.
Nehmen Sie die Bilder mit der Erfassungssoftware auf. Wenn der Fisch erwacht, legen Sie ihn in Tricainwasser, bis er sich stabilisiert hat. Öffnen Sie mit dem Open-Tool in der ImageJ-Software das Bild, das quantifiziert werden soll.
Wählen Sie das Freihandformwerkzeug aus, um den zu analysierenden Bereich zu skizzieren. Wählen Sie die Option "Maße einstellen", klicken Sie auf den mittleren Grauwert und dann auf die Fläche. Um den mittleren Grauwert für den ausgewählten Bereich zu berechnen, klicken Sie auf M oder gehen Sie zu Analysieren und wählen Sie Messen.
Übertragen Sie die Embryonen je nach interessierendem Stadium in eine Petrischale, die 0,6 Milligramm pro Milliliter Pronase enthält. Übertragen Sie die dechorionierten Embryonen mit einer Pasteurpipette nach fünf bis 10 Minuten in eine Petrischale mit klarem Embryowasser. Mit einer Pasteurpipette aus Glas werden etwa 100 Embryonen gesammelt und in ein zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Entsorgen Sie das Medium und fügen Sie 200 Mikroliter eiskalte Ringers-Lösung hinzu. Legen Sie das Röhrchen auf Eis und mischen Sie den Inhalt etwa 20 Mal mit einer Pipette, um das Joch aufzulösen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen zweimal eine Minute lang bei vier Grad Celsius bei 100 G und entsorgen Sie den Überstand.
Übertragen Sie die mit einem Milliliter gefüllten Embryonen mit einer Ein-Milliliter-Pipette in eine Petrischale mit 10 Millilitern Trypsinlösung. Mischen Sie die Lösung ein- oder zweimal mit einer Ein-Milliliter-Pipette, um die Aggregation zu verringern. Führen Sie die trypsinisierte Suspension durch ein 70-Mikrometer-Sieb, das auf einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist, um eine einzellige Suspension aufzufangen.
Waschen Sie die Petrischalen mit der trypsinisierten Suspension, um die anhaftenden Zellen von der Oberfläche zu entfernen. Um die fluoreszenzmarkierten Zellen mit einem Durchflusszytometer zu zählen, zeichnen Sie nach dem Erstellen eines neuen Experimentordners ein Vorwärts- und Seitenstreudiagramm. Erstellen Sie ein Histogramm für die Intensität von Fluoresceinisothiocyanat.
Laden Sie zuerst die Wildtypzellen, um die Vorwärts- und Seitenstreugates und den FITC-Schwellenwert festzulegen. Anschließend werden die aus transgenen FTYRP-GFP-Embryonen isolierten Zellen geladen, um die Melanozyten zu zählen. Montieren Sie die Embryonen in 1,5 bis 2% Methylcellulose in einer Petrischale.
Legen Sie es unter das Mikroskop und stellen Sie es mit einer Pipettenspitze in die gewünschte Ausrichtung ein. Erfassen Sie die Bilder mit der Erfassungssoftware. Bei Embryonen mit weniger als 24 HPF wird mit 10-facher Vergrößerung das gesamte Bild aufgenommen, während bei Embryonen mit mehr als 24 HPF mehrere Scanfelder erfasst und anschließend zusammengesetzt werden.
Nach Durchführung des Assays zeigte die Brightfield-Bildgebung nach 48 Stunden das Vorhandensein aller fünf pigmentierten Melanophorstreifen. Im 48-HPF-Stadium wurde die Anzahl der lateralen Melanophoren berechnet und es wurde festgestellt, dass die H2AFV-Morphanten der Histonvariante im Vergleich zur Kontrolle eine reduzierte Anzahl von Melanophoren aufwiesen. Der mittlere Grauwert wurde für CA14- und h2afv-Morphanten gemessen, was zeigte, dass die Werte für die Varianten höher waren als für die Kontrollmorphanten.
Unter Verwendung einer auf Natriumhydroxid basierenden spektrophotometrischen Absorptionsmethode wurde der Melaningehalt quantifiziert, wobei die CA14-Morphanten einen geringeren Gehalt aufwiesen als die Kontrollmorphanten. Die Fluoreszenzbildgebung wurde durchgeführt, um die morpholinobasierte Veränderung für verschiedene Stadien der Melanophorenentwicklung von Zebrafischen zu bewerten. Die Anzahl der Melanophoren in CA14- und h2afv-Morphanten wurde mittels FACS analysiert.
Es wurde beobachtet, dass die Anzahl der Melanophoren in CA14 unverändert blieb, während sie in h2afv im Vergleich zum Kontrollmorphanten signifikant reduziert waren. Die mittlere Fluoreszenzintensität pro Fläche wurde ebenfalls berechnet, was zeigt, dass die h2afv-Morphanten eine signifikante Abnahme des Wertes im Vergleich zu den Kontrollmorphanten aufweisen. Stellen Sie beim Anpassen des Fisches vor der Bildgebung sicher, dass Sie alle fünf Melanophorstreifen visualisieren können.
Sie müssen den Fisch ein wenig neigen, um zwischen den beiden Seitenstreifen zu unterscheiden. Nachdem wir die Rolle eines Kandidatengens bei der Entwicklung von Melanozyten festgestellt haben, können wir das Gen mit Hilfe der CRISPR-Technologie gewebespezifisch eliminieren. Das wird ein gezielterer Ansatz sein.
