Diese Arbeit wurde von The Wellcome Trust, Glaxosmithkline (GSK) und der schottischen Institut für Zelluläre Signaltransduktion (jetzt Teil des MRC Protein-Phosphorylierung und Ubiquitinierung Unit) unterstützt.

1. Assay Development Stage Hinweis: vor dem Beginn des siRNA-Bildschirm, ist ein Assay Entwicklungsphase entscheidend wichtige Parameter für das Screening mit dem Reporter-Zelllinie festzulegen. Es ist wichtig, erhebliche Anstrengungen in dieser Phase zu investieren, da dies den zukünftigen Erfolg des Bildschirms zu untermauern. <ol><li> Um die Reaktionsfähigkeit der Hypoxie-U20S-HRE-Reporterzelllinie zu charakterisieren, wachsen 2 x 75 cm 2-Kolben von U20S-HRE-Zellen zu 80-90% Konfluenz in Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS. </li><li> Saugen Sie die Medien aus einem Kolben von Zellen, zweimal waschen mit 10 ml PBS und lösen die Zellen durch Zugabe von 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. Die Zellen in 8 ml DMEM 10% FBS und Pipette auf und ab, um eine homogene Zellsuspension erstellen. </li><li> Je 20 ul der Suspension auf eine Zellzählung Kammer, in zweifacher Ausfertigung, und die Kammer einfügen in eine automatisierte Zelle counter. Klicken Sie auf &quot;Anzeigebild&quot; auf der Zellzähler Software und sicherzustellen, dass die Zellen im Fokus. Klicken Sie auf &quot;Count&quot; und notieren Sie sich die Zelldichte. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die andere doppelte und berechnen die durchschnittliche Zelldichte. Verdünne die Zellen mit DMEM 10% FBS in einer Konzentration von 60.000 Zellen / ml. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette 100 ul (6.000 Zellen) der verdünnten Zellen auf die gleichen drei Spalten (z. B. A5-H5, H6 A6-und A7-H7) von 5 sterilen weißen Mauern 96-Well-Assay-Platten, und Transfer zum einer befeuchteten 37 ° C Inkubator bei 5% CO 2 über Nacht. Hinweis: diese Platten verwendet werden, um die Hypoxie-abhängigen Luciferase-Ausgang für eine Reihe von Hypoxie Engagements bestimmen: 0 h, 2 h, 6 h, 10 h und 24 h. </li><li> Am Ende des folgenden Tages, notieren Sie die Zeit und fügen Sie die 24-Stunden-Hypoxie Platte auf die Hypoxie-Workstation auf 1% Sauerstoff. Am nächsten Morgen, die Berechnung der Zeit 10 h, 6 h und 2 h vor der 24-Stunden-Platte aufgrund fr entfernt werdenom die Hypoxie-Workstation. Zu diesen Zeiten, fügen Sie die 10 h, 6 h und 2 h Platten an der Hypoxie-Workstation. </li><li> Vorbereitung 30 ml 2x kombiniert Luciferase Lyse / Assay-Puffer (50 mM Tris-Phosphat pH 7,8, 16 mM MgCl 2, 2 mM DTT, 2% Triton-X-100, 30% Glycerin, 1 mM ATP, 1% BSA, 0,25 mM Luciferin und 8 &amp;mgr; M Na 4 P 2 O 7). Anmerkung: Die Komponenten in der aufgeführten Reihenfolge und damit die BSA mindestens 30 min vor der Zugabe von Luciferin und Na 4 P 2 O 7 zu lösen. </li><li> Entfernen Sie alle Platten von der Hypoxie-Workstation zu gegebener Zeit. 100 l 2x Luciferase-Lyse / Assay-Puffer in die entsprechenden Vertiefungen der Testplatte und Abdeckung mit Klarsichtfolie. Schütteln Sie die Platten auf einem Plattenschüttler für 10 min bei 500 Umdrehungen pro Minute, um gründlich zu lysieren die Zellen. </li><li> Übertragen Sie die Plattenstapel zu einem automatisierten 96-Well-Platte Luminometer Rack. Unter dem Menü &quot;Protokolle&quot;, wählen Sie &quot;abs 595&quot;, und markieren Sie alle wells in der On-Screen-Platte Karte unter dem Menü &quot;Auswahl gut&quot; gelesen werden. Klicken Sie auf &quot;Run&quot;, um Lumineszenz von jedem messen und berechnen dann die durchschnittliche Lese jeder Platte. Berechnen Sie die Hypoxie-abhängigen facher Anstieg der Reporteraktivität durch Division der Durchschnittswert der einzelnen Hypoxie Platte durch die durchschnittliche Lese der Normoxie (0 h Hypoxie) Steuerplatte. Hinweis: Es ist wichtig, um eine robuste Hypoxie-abhängigen Luciferase-Reaktion zu beobachten für das Screening geeignet sind. Ein fünfzehnfachen Erhöhung der Reporteraktivität gilt als ausgezeichnet. </li><li> Erstellen Sie ein Master-Steuerplatte, die vier Hochsteuer (HIF1A siRNA) Wiederholungen (wells A1-D1), vier Low-Regelung (FIH1 siRNA) repliziert (Brunnen A12-D12) enthält, nur vier Puffer Kontrolle Wiederholungen (Brunnen E1-H1) und vier Nicht-Ziel-siRNA Kontrollwiederholungen (E12-H12), wobei alle Pools siRNA in einer Konzentration von 200 nM. Hinweis: High-und Low-Steuerelemente werden basierend auf bekannten Weg Regulatoren, und erhöhen decr gegründeterleichtern die Hypoxie-Antwort auf. Alternativ kann der Assay-Entwicklung unter Verwendung einer Teilmenge der Bibliothek verwendet werden, um geeignete Steuerungen zu identifizieren. </li><li> Mit einer Mehrkanal Pipette 10 ul jeder Kontroll-siRNA in einen sterilen weißen Mauern Testplatte. Bereiten Transfektion Mischung von 0,1 ul Transfektionsreagenz in 10 ul reduzierten Serummedium (1:100) pro Vertiefung und Transfer 10 ul Transfektionsmischung jeder Steuer gut. Pipette auf und ab kurz zu mischen, und lassen Sie die Platte für 20-60 min ruhen der Transfektion Komplexbildung zu ermöglichen. </li><li> Bereiten Sie eine Zellsuspension von 75.000 Zellen / ml mit der zweiten Flasche U20S-HRE-Zellen. Mit einer Mehrkanal-Pipette 80 ul (6.000 Zellen) der Zellsuspension in jede Transfektion Mix. Übertragen Sie die Platte an einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 für 24 Stunden, dann zu einer Hypoxie-Workstation übertragen für weitere 24 Stunden und führen Luciferase-Assays wie in den Schritten 1,6-1.8. </li><li> Berechnen Sie den Z-Faktor für den hohen und niedrigen Kontrollen mit Hilfe der Formel Z = 1 - [3 x (Standardabweichung der hohen Steuer + Standardabweichung der niedrigen Steuer) / (Mittelwert der hohen Steuer - Mittel der niedrigen Steuer)]. Hinweis: Ein Wert zwischen 0,5 bis 1 zeigt eine ausgezeichnete Test und sollte angestrebt werden. </li></ol> 2. Primäre Bildschirm Hinweis: einmal diese Grundbedingungen aus der Testentwicklungsphase vorhanden sind, der primäre Bildschirm kann in dreifacher Ausfertigung in 96-Well-Plattenformat mit dem folgenden Protokoll durchgeführt werden. <ol><li> Wachsen 7 x 75 cm 2-Kolben von U20S-HRE-Zellen 80-90% Konfluenz in DMEM, ergänzt mit 10% v / v fötalem Rinderserum (FCS). Hinweis: Die folgenden Schritte 2,2-2,13 sollte am Tag 1 durchgeführt werden. </li><li> Initiieren Sie ein Replikat hergestellt, indem ein Master-Steuerplatte, die 200 ul jeder Kontrolle, wie in Schritt 1.9 und Auftauen eine Verdünnungsreihe der siRNA ubiquitome l beschriebenibrary für mindestens 30 min. Hinweis: enthält jede auch einen Pool von vier siRNAs in 17 x 96-Well-Platten mit den Spalten 1 und 12 zusammengesetzt leer für Kontrollen. </li><li> In einer Steril, Etikett (oder Bar-Code) 17 sterile weiße Mauern Testplatten mit Deckel aus Zahlen von 1 bis 17, entsprechend jeder Platte des siRNA-Bibliothek-Serie. </li><li> Zentrifugieren Sie die Master-Steuerplatte und die siRNA-Bibliothek ubiquitome kurz (1 min bei 2.000 xg), um sicherzustellen, dass alle siRNAs sich am Boden des Brunnens. </li><li> Verwenden Sie eine automatische Flüssigkeitsspender, um Roboter &quot;Stempel&quot; 10 ul jeder Kontrolle von der Hauptsteuerplatte auf den 17 Testplatten mit dem gleichen 96-Loch-Spitze-Stack für jede Platte. </li><li> Verwendung einer frischen 96 Vertiefungen Spitze Stapel für jedes der Bibliotheksplatten 17, Transfer 10 ul jeder ubiquitome siRNA zu seinem entsprechenden Testplatte unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsabgabevorrichtung. </li><li> Bereiten Sie 40 ml Transfektionsreagenz für die 17 Testplatten mit den Verhältnis es1.10 tablished. Hinweis: Diese enthält zusätzlich 20 ml für die &quot;Totvolumen&quot; in der Zellspender zu berücksichtigen. Der &quot;tote Volumen&quot; bezieht sich auf das Volumen der Flüssigkeit kontinuierlich im Rohrleitungsnetz in der Zelle vorhanden Spender. </li><li> Eine automatisierte Zellspender zu 10 &amp;mgr; l Transfektionsreagenz in jede Vertiefung der 17-Assayplatten übertragen. Kurz schütteln die Testplatten auf einem Schüttler (1 min bei 500 Umdrehungen pro Minute), um eine gute Durchmischung von siRNA und Transfektionsreagenz zu ermöglichen, dann lassen noch bei Raumtemperatur für 20-60 min auf siRNA ermöglichen: Transfektionsreagenz Komplexbildung. </li><li> Zweimal waschen mit zwei 75 cm 2-Kolben von U20S-HRE-Zellen mit 10 ml PBS und nehmen mit 2 ml Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 5 min. In 8 ml DMEM 10% FBS zu jedem Kolben und Pipette nach oben und unten mehrere Male, um eine homogene Zellsuspension erstellen. Kombinieren Sie Zellen aus beiden Flaschen und Transfer in ein steriles 50 ml-Kunststoffrohr. </li><li> Berechnen Zellkonzentration durch Pipettieren20 ul Zellen in zweifacher Ausfertigung zu einer Zellzählung Kammer und die Berechnung der durchschnittliche Zellkonzentration von zwei Lesungen eines automatisierten Zellzähler wie in Schritt 1.3 beschrieben. </li><li> Planen 155 ml Zellsuspension verdünnt mit DMEM 10% FBS in einer Konzentration von 75.000 Zellen pro ml in sterile Kunststoffbehälter. Hinweis: Dieses Volumen ist ausreichend für 17 Platten und enthält zusätzlich 25 ml für das Totvolumen in der Zellspender. </li><li> In einer sterilen Magnetrührer zu der Zellsuspension und auf ein Rührwerk im Inneren des Steril gesetzt, um die Zellklumpenbildung zu begrenzen. Äquilibrieren die automatisierte Zellspender mit der Zellsuspension und setzen ihn auf 80 ul der Zellen pro Well (6000 Zellen) zu verzichten. </li><li> Legen Sie jede der 17 Platten, die wiederum auf die automatisierte Zellspender und verzichten Zellen. Aufzeichnen der Zeit und Stapel Platten in Gruppen von 5 platzieren Stapel in einer feuchten 37 º C-Inkubator bei 5% CO 2 für 24 Stunden. Hinweis: die EndkonzentrationsiRNA Pool wird 20 nM in 100 ul Gesamtvolumen sein. Hinweis: Die folgenden Schritte 2,14-2,15 sollte am Tag 2 durchgeführt werden. </li><li> Initiieren Sie die zweite Wiederholungs am Tag 2 nach dem Verfahren in Tag 1 für replizieren 1 (2,2 bis 2,13) ​​skizziert. </li><li> Nach 24 Stunden der Transfektion, Übertragungsplatten aus Replikat 1 in einer sterilen Umgebung zu einer Hypoxie-Workstation mit 1% Sauerstoff eingestellt und lassen für 24 Stunden, um die HRE-Reporter zu induzieren. Hinweis: Die folgenden Schritte 2,16-2,20 sollte an Tag 3 durchgeführt werden. </li><li> Initiieren Sie die dritte Replikat nach dem Verfahren in Tag 1 für replizieren 1 (2,2 bis 2,13) ​​skizziert. </li><li> Nach 24 Stunden der Transfektion, Übertragungsplatten aus Replikat 2 in einer sterilen Umgebung zu einer Hypoxie-Workstation mit 1% Sauerstoff eingestellt und lassen für 24 Stunden, um die HRE-Reporter zu induzieren. </li><li> Zwei Stunden vor replizieren 1 Platten sind der Hypoxie-Arbeitsstation entfernt werden, bereiten 2x 200 ml Luciferase-Lyse / Assay-Puffer wie in 1.6 beschrieben. Hinweis: dieses Volumen inumfasst weitere 20 ml, um sicherzustellen, der Pufferspeicher bleibt gut abgedeckt. </li><li> Entfernen replizieren ein Assay-Platten aus der Hypoxie-Workstation nach 24 Stunden Hypoxie-Exposition und mit Hilfe eines automatisierten Flüssigkeitsspender, 100 l 2x Luciferase-Lyse / Assay-Puffer zu jedem Testplatte und Abdeckung mit Klarsichtfolie. </li><li> Schütteln der Platten auf einem Zell Schüttler für 10 min bei 500 rpm, um gründlich die Zellen zu lysieren. Übertragen Sie jede Platte wiederum mit einem Luminometer Plattenlesegerät und Platten Lumineszenz, wie in Schritt 1.8 beschrieben. Hinweis: Die folgenden Schritte 2,21-2,22 sollte am Tag 4 durchgeführt werden. </li><li> Nach 24 Stunden der Transfektion, Übertragungsplatten aus Wiederholungs 3 in einer sterilen Umgebung zu einer Hypoxie-Workstation mit 1% Sauerstoff eingestellt und lassen für 24 Stunden, um die HRE-Reporter zu induzieren. </li><li> Lesen Sie das Replikat 2 Platten durch folgende Schritte 2,18-2,20 für replizieren 1 verwendet wird. Hinweis: der folgende Schritt 2.23 sollte an Tag 5 durchgeführt werden. </li><li> Lesen Sie die Wiederholungs 3 Platten von folgenden2,18-2,20 Schritt für replizieren 1 verwendet wird. </li><li> Kompilieren aller drei Replikate des primären Bildschirm, und berechnen Sie den Z-Faktor für jede Platte nach der Formel in 1.12 gegeben. Hinweis: wenn eine Platte hat eine Z-Faktor von weniger als 0,5, betrachten Wiederholung dieser Platte, um die Datenqualität zu verbessern. </li><li> Berechnen Sie den Variationskoeffizient (CV) für die hohen und die niedrigen Steuerelementen mithilfe der folgenden Formel: 100 x Standardabweichung der Kontrolle / durchschnittlich Kontrolle. Hinweis: Lebenslauf sollte so niedrig wie möglich sein, ist es sinnvoll, von 10 bis 15% Abweichung zu erwarten. Wenn Variation ist deutlich höher, betrachten Wiederholung der Platte. </li><li> Berechnen Prozent Aktivierung jeder siRNA pro Platte mit Hilfe der folgenden Formel: [(Mittelwert der hohen Steuer - siRNA score) / (Mittelwert der hohen Steuer - Mittel der niedrigen Steuer)] x 100 Darüber hinaus berechnen die Nicht-Ziel-(NT. )-fache der einzelnen siRNA unter Verwendung der Formel [Sample data / Mittelwert von NT]. Für beide Prozent-Aktivierung und NT-fach, berechnen Sie den Durchschnitt der drei replicAtes und kompilieren Sie die Werte. </li><li> Mit den Rohdaten, die Berechnung der Spearman Rangkorrelationskoeffizient (SRCC), um zu bestimmen, wie eng die drei Wiederholungsplatten korrelieren mit der Formel: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51572/51572eq1.jpg" width="120" /> wobei r = SRCC; d = Differenz zwischen den beiden Zahlen in jedem Paar von Reihen und n = Anzahl der Paare von Daten. Hinweis:. Eine gute Korrelation zwischen Platte Wiederholungen werden Werte in der Nähe, um 1 Wenn ein Replikat zeigt niedrigen SRCC gegen die anderen 2 Platten, weiter zu untersuchen und prüfen, zu wiederholen, dass Platte. </li><li> Entscheiden Sie, welche siRNAs für Sekundärscreening (bis zu 80) ausreichender Interesse sind. Beschäftigen benutzerdefinierte Cut-Offs (zB Auswahl aller siRNAs, die weniger als 5% oder über 95% Prozent-Aktivierung, oder weniger als 0,5 NT-fach oder mehr als 1,5 NT-fach) oder wenden Bioinformatik oder wissensbasierte Argumentation für Cluster suchen trifft innerhalb der gleichen UBL Weg fallen. Hinweis:Normalerweise wird eine Kombination dieser Methoden bestimmt, welche siRNA in sekundären Screening genommen. </li></ol> 3. Sekundäre Bildschirm Hinweis: eine bestätigende sekundären Bildschirm wird auf der Grundlage einer maximal 80 siRNAs von Interesse aus der primären Bildschirm durchgeführt. Diese Zahl kann bequem mit jeder Wiederholung mit vollen Kontrollen nach dem ersten Bildschirm auf einem einzigen 96-Loch-Platte plattiert (siehe 2.2) durchgeführt werden. Es ist sehr nützlich, um zu bestätigen, dass die in der primären Bildschirm identifiziert Regula reproduzierbar entlocken den gleichen Phänotyp, und dies wird in die Verfeinerung der Triage-Entscheidungen, auf die trifft sollte bis zum letzten tertiären / Entfaltung Bildschirm durchgeführt werden zu unterstützen. <ol><li> Wachsen 1 x 75 cm 2-Kolben-HRE U20S-Zellen 80-90% Konfluenz in DMEM mit 10% FBS. </li><li> Notieren Sie sich die Kennzeichen und den Standort der primären Bildschirm Hits, und planen ihre neue Position auf dem zweiten Bildschirm Kirschen gepflückt Masterplatte, so dass die Spalten 1 eind 12 kostenlos für Kontrollen. Bereiten Sie die Masterplatte wie in 1.9, aber mit einem Gesamtvolumen von jedem Steuer von 50 pl. </li><li> Tauen Sie eine zweite Verdünnungsreihe der ubiquitome Bibliothek (beiseite für cherry-picking einzelnen siRNA-Pools) für mindestens 30 min. Zentrifugieren Sie die Platten kurz (1 min bei 2.000 xg) fügen Sie dann 50 ul der sekundären Bildschirm siRNAs, um ihre neue Platte Orten auf der Kirschen gepflückt Masterplatte. </li><li> Führen Sie den zweiten Bildschirm mit der gleichen Basisprotokoll für den primären Bildschirm mit folgenden Änderungen vor: (a) alle drei Wiederholungen laufen am selben Tag in einer Testplatte pro Wiederholung und (b) einstellen Volumina von Reagenzien entsprechend. </li></ol> 4. Tertiär / Entfaltung Bildschirm Hinweis: tertiäre oder Entfaltung Screening ist auf maximal 20 siRNAs aus dem sekundären Bildschirm durchgeführt. Dieser Schritt besteht darin, die Wirkung der Zuschlags prüfen unter Verwendung jedes einzelnen siRNA vom ursprünglichen Pool von vier. Normalerweise sollte mindestens zwei Einzel siRNA-Doppelstränge aus jedem Pool denselben Phänotyp unerlaubt auf ein vernünftiges Maß an Vertrauen, dass der beobachtete Phänotyp ist nicht durch siRNA Off-Target-Effekte haben. Um das Vertrauen in diesem Stadium weiter zu erhöhen, können zusätzliche einzelne siRNA-Duplexe Targeting das betreffende Gen konstruiert und auf ihre Fähigkeit, die gegebenen Phänotyp hervorrufen getestet werden. Ergebnisse aus diesen Experimenten kann dann verwendet werden, um die Punktzahl H, wobei H = 0,6 oder mehr (das heißt, wenn mindestens 3 der 5 einzelnen siRNAs hervorrufen den Phänotyp) als akzeptabel 6 zu berechnen. <ol><li> Wachsen einem 75 cm 2-Kolben-HRE U20S-Zellen 80-90% Konfluenz in DMEM mit 10% FBS. </li><li> Erstellen Sie eine Platte Karte für den tertiären Bildschirm durch die Planung der Lage der vier einzelnen siRNA-Doppelstränge von jedem Treffer auf dem Bildschirm tertiären Masterplatte, so dass die Spalten 1 und 12 frei für Kontrollen. Bereiten Sie die Masterplatte wie in 1.9, sondern mit einem GesamtLautstärke der einzelnen Steuer von 50 ul. </li><li> Tauen die Entfaltung / siRNA einzelnen Platten und 50 ul der einzelnen siRNAs (200 nM) in jede Vertiefung des tertiären Bildschirm Masterplatte entsprechend der Platten Karte (4.2) für drei x 10 ul Wiederholungen und eine komfortable 20 ul Über ermöglichen . </li><li> Führen Sie die tertiäre Bildschirm mit der gleichen Basisprotokoll für den primären Bildschirm beschrieben mit folgenden Änderungen: (a) alle drei Wiederholungen laufen am selben Tag in einer Testplatte pro Wiederholung und (b) einstellen Volumina von Reagenzien entsprechend </li></ol> Hinweis: Idealerweise sollte die Schwelle für die einzelnen siRNA-Doppelstränge sollten die gleiche Stringenz eingestellt werden abgeschnitten als für den Pool. Jedoch kann es akzeptabel sein, um die Schwelle von 10-20% für einzelne siRNAs entspannen, insbesondere wenn zumindest einer anderen Duplex innerhalb der eingestellten Schwellenwert fällt. Es lohnt sich, unter Berücksichtigung, dass die individuelle Wirkung von siRNAs kann weniger sein als die derder Pool, und umgekehrt, in einigen Fällen einzelne siRNAs kann eine stärkere Wirkung auf die zelluläre Phänotyp in Isolation, als wenn es in den Pool (auch bei Konzentration wird berücksichtigt) existiert zu zeigen.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Verwendung von genomweiten siRNA-Bildschirme in Säugerzellen hat sich als äußerst wertvoll bei der Identifizierung neuer Regulatoren von verschiedenen biologischen Wege zu sein. Hier haben wir den Einsatz einer gezielten ubiquitome siRNA Bildschirm, um Regulatoren des HIF1A-vermittelte zelluläre Antwort auf Hypoxie zu identifizieren beschrieben. Gezielte Bildschirme werden immer attraktiver, da sie in der Regel billiger, schneller, einfacher zu verwalten und Bericht nur auf den Weg Komponenten, in denen die Ermi...

Modifikation von Proteinen mit Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen Molekülen (UBLs) stellt eine expansive biochemischen Systems, die verschiedene biologische Pfade und Stress-Reaktionen reguliert. Die kovalente Bindung von UBLs ihre Zielproteine ​​können verschiedene Ergebnisse Regulierung der Stabilität, Lokalisierung, Funktion oder interactome des Substrats 1 aufweisen. Die enzymatischen Schritte UBL Änderung zugrunde liegenden wurden zunächst für Ubiquitin gegründet, und jetzt als Paradigma für die Modifikation mit den meisten UBLs, einschließlich SUMO, NEDD8, ISG15 und FAT10 zu dienen. Für die Modifikation auftritt, wird die Carboxylatgruppe des UBL Diglycin Motiv zunächst durch einen aktivierenden Enzym E1 aktiviert, um einen Hochenergie-thiol, die dem Cystein des aktiven Zentrums eines konjugierenden Enzym E2 übertragen wird, zu bilden. Die E2 interagiert dann mit einem substratgebundenen E3-Ligase, um die Übertragung des UBL auf (in der Regel) eine Ziellysinrest Schaffung eines verzweigtkettigen (Isopeptid) Zugstange 2 zu vermitteln. Aufeinanderfolgende Runden der Modifikation kann auftreten Isopeptid Ketten auf dem Substrat, die für Ubiquitin kann durch jedes der sieben Lysine auftreten oder durch ihre N-terminale Methionin zu bauen, um lineare Ubiquitin-Ketten zu erzeugen. Diese Änderungen bilden diskrete Topologien mit verschiedensten Zwecke wie die Erstellung von neuen Interaktionsmotiven und Targeting-Proteine ​​für den Abbau vor UBL Entfernung durch Fach Proteasen. Im Fall von Ubiquitin zwei E1 Enzyme, 30-40 E2 konjugierenden Enzyme, mindestens 600 E3-Ligasen und etwa 100 deubiquitylating Enzyme (DUBs). Während die Wege sind für die anderen 10 oder so UBLs weniger expansiv, bietet die Gesamt ubiquitome Komplexität große Vielfalt in der biologischen Ergebnis einer bestimmten UBL Änderung. , Während die großen Fortschritte in der UBL Biologie gemacht worden sind, die genauen zellulären Rollen von der Mehrheit dieser ubiquitome Komponenten bleiben jedoch unbekannt. Die Verwendung von short interfering Ribonukleinsäure (siRNA) als ein mächtiges Werkzeug in der reversen Genetik aufgrund der Fähigkeit von siRNAs, um gezielt zellulären mRNAs für die Zerstörung entstanden, so dass die Rolle einzelner Gene in verschiedenen biologischen Zusammenhängen 3 untersucht werden. Gesamtgenom-Bildschirme wurden zur Identifizierung und Validierung neuer Regulatoren vieler zellulärer Prozesse und haben eine Fülle von nützlichen Daten zugänglich zu weiteren wissenschaftlichen Community. Doch während des gesamten Genoms Bildschirme äußerst nützlich erwiesen, sind gezielte Bildschirme immer beliebter, da sie billiger sind, schneller, beinhalten weniger Datenmanagement und Bericht nur auf Mitglieder des Genoms, in dem die Ermittler am meisten interessiert. Deshalb, um besser zu verstehen, welche zellulären Prozesse UBL Familien Komponenten beteiligt sind, haben wir eine menschliche siRNA-Bibliothek gezielt alle bekannten und vorhergesagten Komponenten des ubiquitome zusammengestellt. Dies beinhaltet die UBLs, E1 aktivierende Enzyme, E2 konjugierendeEnzyme, E3-Ligasen, Ubiquitin-bindende Domäne (UBD) enthaltende Proteine ​​und DUBs. Diese Bibliothek kann auf Bildschirm gegen ein breites Spektrum von Reporter-Zelllinien von verschiedenen biologischen Fragestellungen verwendet werden, so dass die unvoreingenommene Identifizierung neuer Komponenten UBL über diese Wege. Das folgende Protokoll beschreibt, wie eine strenge gezielte siRNA ubiquitome Bildschirm, um neue Regulatoren der HIF1A abhängige Reaktion auf Hypoxie zu identifizieren durchzuführen. Unter normalen Sauerstoffspannung ist HIF1A unterliegen Prolylhydroxylierung, die es von der Von Hippel Lindau (VHL)-E3-Ligase-Komplex 4 erkannt und für den Abbau gezielt verursacht. Hypoxie hemmt Prolylhydroxylierung, die zur Stabilisierung der HIF1A und die anschließende Bindung an Hypoxie-Response-Elemente (HRE), um die Genexpression zu fahren. Hier mit U20S Osteosarkom-Zellen unter der Kontrolle von drei Tandemkopien der Hy stabil exprimieren Luciferase beschreiben wir eine BildschirmHypoxie-Response-Faktor (U20S-HRE-Zellen) 5. Dieses Protokoll kann für jeden biologischen Weg angepasst werden, wenn ein robustes Auslesen der Reporteraktivität erreichbar ist und mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen gekoppelt werden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:288px;">Automated Liquid Dispenser</td>
			<td style="width:147px;">Fluid-X</td>
			<td style="width:200px;">XPP-721</td>
			<td style="width:156px;">http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Automated cell counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td>http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hypoxia Workstation</td>
			<td>Ruskin</td>
			<td>In vivo2 300</td>
			<td>http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Automated Cell Dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Matrix Wellmate</td>
			<td>http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Plate Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Titramax 1000</td>
			<td>http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Luminometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Envision 2104 Multilabel Reader</td>
			<td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">White Walled Assay Plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655083</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Clear Plate Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1450-461</td>
			<td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name of the Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">siRNA library</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>On-Target Plus</td>
			<td>http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Lipofectamine RNAimax</td>
			<td>http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reduced Serum Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Optimem</td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tryspin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sirna screening to identify ubiquitin and ubiquitin-like system regulators of biological pathways in cultured mammalian cells

Posttranslationale Modifikation von Proteinen mit Ubiquitin und Ubiquitin-artige Moleküle (UBLs) als dynamische Zellsignalisierungsnetz, die verschiedene biologische Pfade einschließlich der Hypoxie-Antwort, Proteostase, die die DNA-Reparatur und Transkription reguliert Schwellen. Um besser zu verstehen, wie UBLs regeln für die menschliche Krankheitsbahnen, haben wir eine menschliche siRNA zusammengestellt &quot;ubiquitome&quot; Bibliothek, bestehend aus 1.186 siRNA-Duplex-Pools gezielt alle bekannten und vorhergesagten Komponenten der UBL-System Wege. Diese Bibliothek kann gegen eine Reihe von Zelllinien, die Reporter von verschiedenen biologischen Wege, um zu bestimmen, die UBL Komponenten wirken als positive oder negative Regulatoren des Weges in Frage zu sehen sein. Hier beschreiben wir ein Protokoll unter Verwendung dieser Bibliothek in ubiquitome-Regulatoren des HIF1A-vermittelte zelluläre Antwort auf Hypoxie mit einem Transkriptions-basierte Luciferase-Reporter identifizieren. Eine erste Testentwicklungsstadiumdurchgeführt, um geeignete Screening-Parameter der Zelllinie, bevor Sie den Bildschirm in drei Stufen festgelegt: Primär-, Sekundär-und Tertiär / Entfaltung Screening. Der Einsatz von über gesamte Genom siRNA-Bibliotheken gezielt wird immer beliebter, denn es bietet den Vorteil der Berichterstattung nur auf die Mitglieder der Weg, mit dem die Ermittler am meisten interessiert sind. Trotz inhärenten Grenzen der siRNA-Screening, insbesondere Falsch-Positiven von siRNA Off-Target-Effekte verursacht, die Identifizierung neuer Regulatoren echt der Wege in Frage, überwiegen diese Mängel, die durch die Durchführung einer Reihe von sorgfältig durchgeführten Kontrollexperimente überwunden werden können.

Vor dem Screening wird die Hypoxie-Reaktionsfähigkeit der HRE U20S-Zellen etabliert. U20S-HRE-Zellen exprimieren ein Reporterkonstrukt, bestehend aus Leuchtkäfer-Luciferase stromabwärts drei Tandemkopien der Hypoxie-Antwortelement, das von der HIF1A/HIF1B Heterodimer bei Einwirkung von Hypoxie (1A) gebunden ist, kondensiert ist. Die Zellen werden in einer Hypoxie-Workstation für eine Reihe von mal zu ermitteln, welche Hypoxie Exposition produziert die wirksamste Antwort für das Screening gestellt. ...

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siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Hier beschreiben wir eine Methode, um eine gezielte siRNA &quot;ubiquitome&quot;-Bildschirm, um neue Ubiquitin und Ubiquitin-ähnliche Regulatoren des HIF1A-vermittelte zelluläre Antwort auf Hypoxie zu identifizieren durchzuführen. Dies kann zu jedem biologischen Weg, wo ein robuster Auslesen der Reporteraktivität ist angepasst werden.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

sirna-screening-to-identify-ubiquitin-ubiquitin-like-system

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Aufrufe.  University of Dundee.  Hier beschreiben wir eine Methode, um eine gezielte siRNA "ubiquitome"-Bildschirm, um neue Ubiquitin und Ubiquitin-ähnliche Regulatoren des HIF1A-vermittelte zelluläre Antwort auf Hypoxie zu identifizieren durchzuführen. Dies kann zu jedem biologischen Weg, wo ein robuster Auslesen der Reporteraktivität ist angepasst werden. 

Serie: siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Forschung

Biologie

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Reverse-Hefe-Zwei-Hybrid-System an Säugetier Nuclear Receptor Rückstände Identifizieren Sie, dass Interagieren Sie mit Liganden und / oder Antagonisten

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...