Der mikrostrukturierende Bast Cell Chirality Assay ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der multizellulären chiralen Morphogenese bei der Entwicklung von Krankheiten. Es ist auch wichtig für die Zellforschung. Dieses Makromustersystem ist einfach herzustellen und zu verwenden, kann äußerst zuverlässige und wiederholbare Ergebnisse liefern und ist auch mit der automatisierten Hochdurchsatzverarbeitung für große Stichprobengrößen kompatibel.
Beginnen Sie mit dem Schneiden des titanvergoldeten Objektträgers in kleine quadratische Stücke von etwa 12 mal 12 Millimetern. Schieben Sie mit einem Glasschneider über die Oberfläche, um eine verbeulte Spur zu hinterlassen, halten Sie dann den Glasschieber auf beiden Seiten und biegen Sie sich an der Delle, um in kleine Viertel zu brechen. Um den Objektträger zu reinigen, tränken Sie ihn mit der Goldseite nach oben in 100% Ethanol, das in einer Petrischale enthalten ist, auf einem Orbitalschüttler für mindestens 10 Minuten.
Nach dem Absaugen des Ethanols trocknen Sie den Objektträger durch Blasen mit einem Stickstoffstrom. Reinigen Sie die Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Stempel mit Seifenwasser, bevor Sie den Stempel mit Stickstoffgas trocknen. Lösen Sie 5,74 Milligramm Octadecanthiol oder C18 in 10 Milliliter 100% Ethanol auf, um zwei millimolare C18-Lösung herzustellen, und reinigen Sie dann die PDMS-Stempel mit 100% Ethanol.
Tränken Sie den PDMS-Stempel mit der Musteroberfläche nach unten in C18-Lösung für 10 Sekunden und trocknen Sie ihn dann 60 Sekunden lang vorsichtig mit Stickstoffgas. Nach dem Trocknen legen Sie den Stempel mit dem Gesicht nach unten für 60 Sekunden auf die Goldrutsche, bevor Sie ihn entfernen. Um eine ordnungsgemäße Prägung zu gewährleisten, klopfen Sie vorsichtig mit der Pinzette auf den Stempel, um die Muster ordnungsgemäß zu übertragen.
Als nächstes bereiten Sie die Feuchtigkeitskammern vor, indem Sie einen Milliliter 70% Ethanol in einen umgekehrten Petrischalendeckel pipettieren. Und legen Sie mit der Pinzette ein Stück Parafilm ab, um die Oberfläche zu bedecken, um sicherzustellen, dass keine Blasen zurückbleiben. Entfernen Sie bei Bedarf das überschüssige Ethanol.
Fügen Sie 40 Mikroliter Tröpfchen EG3-Lösung für jedes Viertelglasobjektträger auf den Parafilm in der Feuchtigkeitskammer hinzu, so dass genügend Platz zwischen den Tröpfchen bleibt, um den Abstand der Goldobjektträger zu berücksichtigen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die C18-gedruckte Goldfolie mit dem Gesicht nach unten auf den Tröpfchen zu legen, um sicherzustellen, dass keine Blasen unter dem Dia verbleiben. Drücken Sie die Dias vorsichtig zusammen, ohne sie anzuheben, um die Verdunstung zu minimieren.
Nachdem Sie die Petrischale fest mit Parafilm verschlossen haben, lassen Sie sie mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur stehen. In einer Biosicherheitskabine den nach oben zeigenden Goldträger dreimal in 70% Ethanol einweichen und spülen, um EG3 zu entfernen, und dann 10 Minuten zur Sterilisation in Ethanol einwirken lassen. Nach dem Absaugen des Ethanols steriles PBS hinzufügen.
Bereiten Sie eine weitere Feuchtekammer mit PBS anstelle von Ethanol vor, wie gezeigt. Als nächstes fügen Sie 50 Mikrolitertröpfchen Fibronektinlösung für jeden Viertelträger auf den Parafilm hinzu, so dass etwas Platz zwischen den Tröpfchen bleibt. Legen Sie dann den Objektträger wie zuvor gezeigt nach unten auf den Tröpfchen und lassen Sie die Petrischale 30 Minuten in der Biosicherheitskabine.
Nachdem Sie die vergoldete Folie dreimal gespült haben, legen Sie die Folie nach oben in PBS. Bevor Sie die Zellen aussäen, erwärmen Sie die Medien und das Trypsin in einem auf 37 Grad Celsius temperierten Wasserbad. Für eine bessere Zellbefestigung den Musterschieber in einer 12-Well-Platte mit Kulturmedien einweichen und bei 37 Grad Celsius im Inkubator erwärmen.
Sobald die Zellen trypsinisiert sind, neutralisieren Sie die Zellen mit FBS-haltigen Medien, pelletieren Sie die Zellen bei 100 mal G für drei Minuten und suspendieren Sie dann das Zellpellet in frischen Medien. Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie die Zellsuspension, um die Konzentration von 200.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen. Fügen Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension zu jeder Vertiefung hinzu, die einen Goldschlitten enthält.
Schütteln Sie die Platte vorsichtig ein paar Mal für eine gleichmäßige Zellaussaat, bevor Sie für 15 Minuten für die Zellbefestigung inkubieren. Überprüfen Sie nach 15 Minuten den Zellaufsatz unter einem Mikroskop und inkubieren Sie bei Bedarf noch einige Zeit. Sobald die Zellen befestigt sind, saugen Sie die Medien, die nicht gebundene Zellen enthalten, aus jedem Brunnen ab und fügen Sie einen Milliliter frisches Kulturmedium hinzu.
Kultivieren Sie die Zellen im Inkubator für 24 Stunden und überprüfen Sie die Konfluenz, um festzustellen, ob sich Chiralität gebildet hat. Wenn die erforderliche Konfluenz erreicht ist, fixieren Sie die Zellen, indem Sie die Kulturmedien entfernen. Nach einmaligem Spülen mit PBS 4%ige Paraformaldehydlösung in den Objektträger geben und die Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubieren, bevor sie dreimal mit PBS erneut gespült werden.
Um die Bilder aufzunehmen, verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop mit Kamerafunktionalität und erfassen Sie jeden Ring auf dem Objektträger mit hoher Auflösung. Laden Sie zur Chiralitätscharakterisierung die MATLAB-Codedateien herunter, fügen Sie den Codeordner und die Unterordner zum MATLAB-Pfad hinzu und öffnen Sie den ROI_selection. M-Datei.
Ändern Sie in Zeile vier das Verzeichnis in den gewünschten Datenordner. Ändern Sie die Bildgröße in Zeile 14, wobei die ersten beiden Abbildungen die innere Kreisgröße des Rings darstellen, während die anderen beiden die äußere darstellen. Um die interessierende Region oder den ROI in den Phasenkontrastbildern zu bestimmen, führen Sie die MATLAB-Code-ROI_selection aus.
m, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Ziehen Sie das Auswahlquadrat manuell an den Ring und doppelklicken Sie dann auf das Bild, um die Auswahl zu bestätigen. Nachdem Sie den ROI aus allen Bildern im Ordner ausgewählt haben, wird eine MAT-Datei generiert, um die ROI-Informationen für jedes Bild zu speichern.
Öffnen Sie dann die analysis_batch. m Datei und ändern Sie das Verzeichnis des Ordners wie zuvor gezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um den Code analysis_batch auszuführen.
m, um die Chiralität mehrerer zellulärer Ringmuster zu bestimmen. Ein datatoexcel. Es wird eine TXT-Datei generiert, die kreisförmige Statistiken für jeden Ring sowie die Anzahl der nicht chiralen und gegen den Uhrzeigersinn gerichteten Ringe enthält.
Die aktuellen Ergebnisse zeigen experimentell den Nutzen des entwickelten Ringmuster-Chiralitätsassays sowie die Empfindlichkeit dieses Assays gegenüber Veränderungen im Zytoskelett. In der vorliegenden Studie wurde festgestellt, dass durch die Störung der Aktinpolymerisation mit 50 nanomolaren Latrunculin-A-Behandlungen die Maus-Myoblasten-C2C12-Zellen eine Veränderung der chiralen Verzerrung gegen den Uhrzeigersinn oder CCW in den Uhrzeigersinn oder CW.In zusätzlich zeigten, die humanen Nabelschnur-vaskulären Endothelzellen oder hUVECs, die mit 12-o-Tetradecanoyl-phorbol-13-acetat oder TPA behandelt wurden, um die Proteinkinase C zu aktivieren, eine dosisabhängige Verschiebung der Zellchiralität von CW zu CCW. Nach der Zellaussaat zu den Mustern können Chemikalien oder Medikamente zum Medium hinzugefügt werden, um die Reaktion zu untersuchen, und das Transwell-System kann integriert werden, um die Zellkokultur zu untersuchen.
Dieser Assay bietet ein effizientes Werkzeug zur Untersuchung der multizellulären Chiralität unter verschiedenen experimentellen Umgebungen und bietet wichtige Einblicke in die Rolle der Zellchiralität in verschiedenen biologischen Phänomenen und Prozessen.
