MA wurde durch ein Schrödinger-Stipendium des Wissenschaftsfonds (FWF, J3086-B11) und dankt der Max-Planck-Gesellschaft für finanzielle und administrative Unterstützung getragen. GS und JH wurden vom Wiener Wissenschafts-, Forschungs- und Technologiefonds (WWTF, LS13-030) unterstützt.

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The authors declare that they have no competing financial interest.

Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ ist sehr erwünscht können insbesondere bei geringen Affinität Wechselwirkungen wie TCR-pMHC Bindung 11. Dies, da die An-Rate als auch die Stabilität eines solchen Wechselwirkungen signifikant durch die besonderen Umstände, unter denen eine Bindung stattfindet, beeinflusst. Minimalinvasive FRET-basierten Imaging-Ansätze sind also im Prinzip perfekt für solche Aufgabenstellungen geeignet, dennoch beinhalten eine Reihe von Hürden, die überwunden werden müssen. Rauschen, das durch zelluläre Autofluoreszenz erzeugten begrenzt die Empfindlichkeit der Messungen und sollte daher auf ein Minimum beschränkt werden. TIRF-Mikroskopie dient dieses Bedürfnis sehr gut 12 erfordert aber die Funktionalisierung von Glasobjektträger, idealerweise in der Form einer ebenen Glasgestützten Lipiddoppelschicht mit Proteinen der Wahl 13-15 eingerichtet. Ein weiterer Vorteil einer teilweise rekonstitutiven Ansatzes ist, dass rekombinante Doppelschicht-Resident FRET-Partner kann sehr viel mErz leicht in quantitativer ortsspezifische und rationelle Weise mit kleineren und heller Fluorophoren markiert, als es mit der Zelloberfläche exprimierten Proteine ​​möglich. TCRs mit rekombinanten scF V s, die T-Zell-Erkennung nicht beeinflussen markiert, wie zuvor 2 getestet wurde. Darüber hinaus ist die Proteinzusammensetzung der SLB, beispielsweise die Dichte pMHCs und die Wahl des Hilfsfaktoren können an einen spezifischen Bedürfnisse angepasst werden. Wir haben zuvor durchgeführten Versuchen mit unterschiedlichen Dichten von stimulierenden pMHCs, aber noch nicht detektierten signifikanten Unterschiede in der 2D-K off und 2D-K D2. Soweit hier die Erkennung von MHC Klasse II-Moleküle mit nur behandelt, vor allem wegen der Art ihrer Peptidbindungsspalte, die an beiden Enden offen ist und somit Platz für größere Peptide einschließlich eines Linkers für Fluorophor Anlage. In einigen Fällen kann ein solcher Ansatz auch für die Kennzeichnung MHC cla arbeitenss-I-Moleküle 16, aber großer Vorsicht zu treffen, um ihre Verwendung in Experimenten zu überprüfen. Die Empfindlichkeit der T-Zellen gegen Antigene, die durch T-Zell-Proliferations-Assays, sowie die pMHC-TCR Bindungskinetik gemessen wie in vitro durch Oberflächenplasmonresonanz gemessen werden durch die Zugabe des Linkers und Fluorophors beeinflusst das Peptid. Alternativ können MHC-Klasse-I-Molekülen, sich in einer ortsspezifischen Art und Weise mit der Einführung eines ungepaarten Cystein innerhalb der Sequenz der schweren Kette (unveröffentlichte Beobachtungen) markiert werden. Mit der Verwendung von geeigneten Molekularsonden jedes synaptischen Protein-Protein-Wechselwirkung können prinzipiell in einer hierin beschriebenen Art und Weise untersucht werden. Solche Sonden, beispielsweise sollte scF V s oder Designed Ankyrin Repeat Proteine ​​(DARPins) 17, monovalente und sollte ihre Ziel stabil zu binden, ohne die Interaktion von Interesse. Natürlich Struktur information für rationales Sondendesign sehr wünschenswert, aber nicht unbedingt erforderlich. Bei der Festlegung eines neuen Paares von FRET-Partner, wird empfohlen, zu erfassen und zu analysieren, FRET in Groß ersten. Seiten der Etikettenbefestigungs kann beträchtlich variiert werden, um die FRET-Signals zu maximieren und auch zu überprüfen, ob gemessen FRET Erträge hängen von der inter-Farbstoff der Entfernung ab. Sobald das System optimiert ist, einzelne FRET-Signale können durch die Begrenzung der Markierung von hoher Häufigkeit FRET Partner auf 10-30%, und das Bleichen des niedriger Abundanz FRET Partner bis einzelne Moleküle auflösbar sind auf dem Gebiet der Beleuchtung erfasst werden. Nicht zuletzt ist darauf hinzuweisen, dass SLBs nähern einige, aber nicht alle Aspekte einer physiologischen Plasmamembran. Eigenschaften wie Membrankrümmung und Flexibilität Domäne Kompartimentierung Umordnung des Cytoskeletts und der Zellbeweglichkeit sowie eine hohe Vielzahl von Oberflächen-exprimierten Membranproteine ​​werden von SLBs dargestellt aber beeinflussen könnten ter untersuchte verarbeiten. Große Anstrengungen müssen investiert, um die bildgebenden Verfahren, die Überwachung der Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Einzelmolekülauflösung in physiologischer Synapsen, die unzugänglich für TIRF Bildgebung ermöglichen festzulegen.

Ein grundlegendes Verständnis davon, wie T-Zellen erkennen Antigene erfordert der Suche an der richtigen Stelle, das heißt, innerhalb der immunologischen Synapse zwischen der T-Zelle und der APC gebildet. Hier Molekular Bindungskinetik werden nicht nur von den inhärenten biochemischen Eigenschaften der Interaktionspartner beteiligt, aber bestimmt ab zu einem großen Teil auf die Zellparameter, die zellulären Kräfte, Membran-Architektur und lateralen Wechselwirkungen zwischen Membranproteinen sowie Synapse spezifischen geometrischen Beschränkungen beinhalten 3. Biochemische Ansätze zu Auflösungsvermögen, da sie die Zerstörung von mindestens einem der synaptischen Membranen beteiligt notwendig beschränkt. Aus diesem Grund wird ein FRET-basierten Imaging-Methode wurde entwickelt, um zu überwachen Bindung des TCR, um antigene pMHCs 2. Hier T-Zellen mit einem rekombinanten eingerichtet und ortsspezifisch TCR &amp; bgr;-reaktives Einzelketten-Antikörperfragment (SCF V) markiert und mit Plan konfrontiert<html> AR-Glas-gestützten Lipiddoppelschichten (SLBs), die MHC Klasse II-Moleküle mit einem fluoreszierend markierten antigenen Peptid beladen, costimulatorischen Molekülen und Adhäsionsproteine ​​zu beherbergen. Synaptischen Bindung zwischen Farbstoff markierten TCR und farbstoffmarkierten pMHC ergibt FRET, der auf einer Masse und Einzelmolekülebene durch Total Internal Reflection Fluoreszenz (TIRF) -Mikroskopie überwacht werden können. In diesem Artikel wird im Detail erläutert, wie man SLBs zur Bestimmung von T-Zellsynapsen zu nutzen, überprüfen Sie ihre Integrität über eine funktionelle T-Zell-Calcium-Flux Assay Verhalten FRET-Messungen in der Masse und mit Einzelmolekülempfindlichkeit und die erfassten Daten zu analysieren. Empfehlungen sind auf die Herstellung einwandfrei angepaßt Proteine, die für Doppelschicht Funktionalisierung erforderlich angeboten. Für genauere Informationen bezüglich Doppelschichtbildung und Aufbau eines geeigneten TIRF-Mikroskop bitte zu einem zusätzlichen Zugang der Öffentlichkeit JoVE Publikation veröffentlicht Rücken an Rücken 4 beziehen. Zelt &quot;&gt; Natur von SLBs Funktionalisierbaren SLBs leicht von unilamellaren Vesikeln (SUVs), welche die beiden Lipide 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-gylcero-3-phosphocholin erzeugt werden (kurz: POPC, 90-99%) und 1,2-Dioleoyl-sn - glycero-3 - {[N (5-Amino-1-carboxypentyl) Iminodiessigsäure] Succinyl} (kurz: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUVs auf sauberen Glasobjektträger verteilt, um eine zusammenhängende planare Doppelschicht 4 zu bilden. DGS-NTA-Ni dazu dient, Polyhistidin-tag-Proteine ​​über Polyhistidin-vermittelte Komplexbildung mit dem synthetischen NTA-Ni-enthaltenden Kopfgruppe (1A) zu verankern. Für stabile Assoziation einer Regel ersetzt die nativen Transmembran-Domäne und den cytoplasmatischen Schwanz des Adhäsionsprotein ICAM-1 und der co-stimulierenden Molekül B7-1 mit einem Tag mit zwölf Histidine (ICAM-1-12h, B7-1 -12H) (1B) . Das Peptid-beladenen Klasse II-Molekül IE k enthält zwei Membran-Embedded (α und β) Polypeptidkettes. Die Trans / zytoplasmatischen Domänen beider Ketten müssen mit einem Tag mit sechs Histidinen jeweils (IE k α 6H β 6H oder IE k -2x6H) ersetzt werden. Als Alternative zur Verlängerung der α-Kette mit zwölf Histidinen und dem Verlassen der extrazellulären Domäne des β-Kette ohne Tags (was zu IE k α 12H β 0H oder IE k -12H) führt zu zufriedenstellenden Ergebnissen (Abbildung 1B). Standortspezifische Kennzeichnung pMHCs Es ist wichtig, um die pMHC stöchiometrisch und ortsspezifisch, um zu kennzeichnen, um in der Lage zu mess FRET Renditen in sinnvolle Gleichgewichtsbindungskonstanten zu konvertieren. Dies kann durch chemische Markierung eines synthetischen Peptids, das in die Peptidbindungsspalte von rekombinanten Histidin-markierten MHC Klasse II-Moleküle geladen 2,5 erreicht wird. Das Peptid umfaßt alle Rückstände des T-Zell-Epitop wie well als eine kurze C-terminale Linker (GGS), gefolgt von Cystein (zB in der Motten Cytochrom c (MCC) Peptid ANERADLIAYLKQATK- GGSC, der Linker ist fett markiert). Dieses Cystein wird verwendet, um das Peptid stöchiometrisch unter Verwendung von Maleimid-Farbstoff-Derivate zu bezeichnen. An dieser Stelle sei besonders vorsichtig, um die Überprüfung quantitative Farbstoff Kopplung an die Cystein-enthaltenden Peptid gewidmet sein. HPLC-Reinigung des Peptids Farbstoff Addukt wird empfohlen und ist vom Elektrospray-Ionisations-Massenspektroskopie verfolgt werden. Etwaige zeichneten Massen entsprechend der Peptid Edukt (ohne Farbstoff) zu reflektieren unvollständige Etikettierung. Wenn dies wahr ist, sollte der HPLC-gereinigte Peptid an aufeinander folgenden Runden von Farbstoff-Markierung unterzogen werden, bis die Kennzeichnung gilt quantitativ. Beachten Sie, dass der MALDI-TOF-Massenspektroskopie sollte vermieden werden, da diese Methode beinhaltet Laserstrahlung für die Proben Ionisation werden. Diese Behandlung löst die beigefügten empfindliche Fluorophore vor Peptidmasse wird ausgelesen und damit underrepre<html> SENTS Grade Farbstoff-Konjugation. Indirekte noch ortsspezifische Markierung von zellgebundenem TCRs mit der Verwendung von monovalenten Einzelketten-Fv-Fragmente Es ist immer noch eine Herausforderung, Farbstoffe oberflächenassoziierten Proteine ​​lebender Zellen in einer ortsspezifischen Weise Zelle zu befestigen. Diese Hürde für oberflächenexponierten TCRs zu überwinden, wurde eine monovalente einkettige Version (SCF V) aus den Genen des TCR &amp; bgr -reaktive monoklonalen Antikörper H57-197 2 errichtet. Die Kristallstruktur dieses Antikörpers im Komplex mit dem TCR ermöglicht, rational zu entwerfen eine Version, bei der ein Serinrest in der Nähe des C-Terminus der MHC-assoziiertes Peptid (wobei die entsprechenden FRET Partner Farbstoff angebracht ist) ist für eine substituierte Cysteinrest. Diese Mutante Cystein dient dann als Akzeptor für Farbstoff-Konjugation (Abbildung 2). Methoden zur FRET aufnehmen nt &quot;&gt; Groß FRET-Werte sind am besten geeignet, um die Beziehung zwischen gewählten Inter-Farbstoff Entfernungen Akkreditierung und FRET-Effizienzen in diesem TCR-pMHC gemessenen Bindungssystem 2. Darüber hinaus Groß FRET-Messungen zeigen, qualitative und quantitative Unterschiede in der synaptischen TCR-pMHC Affinitäten ( siehe unten und Protokoll Abschnitt 3.2). Verschiedene Ansätze zur Quantifizierung der FRET-Effizienzen wurden in der Literatur 6 eingeführt. In über dieser Artikel FRET erfasst (a) Spender Erholung nach Akzeptor Bleichen, und über (b) sensibilisiert FRET-Akzeptor-Emission. Das erste Verfahren (a) erfordert die Verwendung eines FRET-Akzeptor, die leicht gebleicht werden können, und einem Spender, der eher photo ist. Zusätzlich ist es wichtig, sicherzustellen, dass die fotogebleicht Akzeptor ist nicht mehr in der Lage ist das Abschrecken der Donor-Fluoreszenz. Da die gleichen Detektionskanal (Donor) ist für die Quantifizierung verwendet, keine Korrekturfaktoren eind keine chromatischen Aberrationen berücksichtigt werden müssen, was dieses Verfahren einfach und zuverlässig macht. Jedoch können quantitative Messungen nicht auf dem gleichen Punkt der Probe wiederholt werden und Veränderungen in der FRET nicht über die Zeit aufgezeichnet werden. Um Effekte durch molekulare Diffusion oder zellulärer Motilität eine schnelle Bleichstufe angestrebt werden, die die Zeit, die zwischen dem ersten FRET-Donor (vor Akzeptor-Bleichen) und dem zweiten FRET-Donor Bildaufnahme (nach FRET-Akzeptor Bleichen) minimiert zu vermeiden. Es ist zu empfehlen, um eine leistungsfähige Laser-Lichtquelle des FRET-Akzeptor Anregungswellenlänge, um die Beleuchtung und Bleichzeiten zu minimieren beschäftigen. Im Gegensatz dazu in dem Ansatz der sensibilisierten FRET Emissionsmessung (b) der FRET-Donor ist, angeregt und die Emission der FRET-Akzeptor in dem FRET-Akzeptor-Kanal beobachtet. Änderungen im FRET-Akzeptor-Signal kann im Laufe der Zeit aber Emission der FRET-Donor in den roten Bereich verschobenen Akzeptor-Kanal aufgezeichnet werden (termed Durchscheinen) und FRET-Akzeptor Quererregung über Donoranregung müssen genau bestimmt und aus dem aufgezeichneten FRET-Akzeptor-Kanal subtrahiert werden. Hierzu werden die entsprechenden FRET-Donor und FRET-Akzeptor-Bilder sind räumlich ausgerichtet werden. Detektion von Einzelmolekül (sm) FRET-Ereignissen Bei der Verwendung von Lasern als Anregungsquelle, einer empfindlichen Kamera und geräusch gedämpft TIRF-Mikroskopie die Fluoreszenz der einzelnen Fluorophore können leicht über die Zeit verfolgt werden. Ähnliches gilt für den Nachweis der intermolekularen smFRET Ereignisse. Jedoch können Komplikationen durch FRET-Donor Durchbluten und Queranregung des FRET-Akzeptor verursacht werden, und daher mit großer Sorgfalt bei der Einstellung der Fluorophor Dichten im smFRET Versuch genommen werden. In dem Protokoll unten angegeben (Protokoll Abschnitt 4) wurde das TCR als FRET-Donor in hoher Fülle und pMHC als FRET-Akzeptor in geringer Menge ausgewählt. Um FR dämpfenET Spenderdurchscheinen ausreichend, dekorieren 10-30% der TCRs mit fluoreszierenden scF V und 90-70% der TCRs mit nicht-fluoreszierenden scF V. Hier wurde das FRET-Akzeptor-Kanal als Einzelmolekül-Kanal gewählt, weil es mit der konfokalen Einzelmolekül-FRET-Kanal. Dies hilft, smFRET Veranstaltungen mit Einzelmolekül-FRET-Akzeptoren, die die Grundlage der smFRET Validierung auszurichten. Extrahieren von synaptischen off-Raten durch smFRET Messungen Photobleaching beider FRET-Donor-Akzeptor und FRET müssen für beim Extrahieren der Halbwertszeit von Wechselwirkungen von Einzelmolekül-FRET-Spuren berücksichtigt werden. Die Anzahl der beobachtbaren FRET-Signale zu Beginn ihres Auftretens als Einzel Donor-Akzeptor-Paar N (0) wird über die Zeit sowohl unverbindlich des Rezeptor-Ligand-Komplex und Photobleich reduziert. Die Zahl der überlebenden Komplexe zu einem bestimmten Zeitpunkt N (t) kann mathematisch wie folgt ausgedrückt werden: In der Photoblei Ausdruck exp (-t / τ Bleichmittel) ist die Zeit t durch das Produkt aus der Anzahl der Beobachtungen n und der Beleuchtungszeit t schlecht aufgrund der nicht-kontinuierlichen, diskreten Betrachtungsmodus (dh Bleichen während der Beleuchtung tritt nur beschrieben ). Innerhalb der kinetischen Term exp (t / τ off) die Zeitdauer t ist das Produkt aus der Anzahl der Beobachtungen n und dem Zeitpunkt t lag für einen einzelnen FRET Beobachtung (dh kontinuierlich geschieht kinetische freibleibend). Gleichung 1 kann wie folgt ausgedrückt werden: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> Der Begriff τ Bleichmittel / τ krank describes die Anzahl der Beobachtungen bis Bleich auftritt und ist definiert als der Erwartungswert &lt;n bleichen&gt; der Exponentialfunktion. Gleichung 2 kann wie folgt vereinfacht werden: <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> Der Erwartungswert &lt;n (t lag)&gt; der Anzahl von Rahmen N (t) mit beobachtbaren FRET-Ereignissen nach der Zeit t wird direkt aus dem Experiment bestimmt. Es hängt von der einstellbaren Zeit zwischen Beobachtungen (t lag) in das Experiment ausgewählt und die unbekannten Werte für τ off (das Inverse der off-Rate k off) und &lt;n bleichen&gt;, den Erwartungswert der Anzahl der Beobachtungen vor dem Bleichen auftritt . So Berechnung des Erwartungswertes &lt;n (t lag)&gt; für mindestens zwei Werte von t <sub&gt; Verzögerung ermöglicht die experimentelle Bestimmung der &lt;n bleichen&gt; und &amp; tgr; aus. Extrahieren von synaptischen 2D-K D Werte durch FRET-Messungen Messen TCR Belegung ein, dh das Verhältnis zwischen gebundenen TCRs und insgesamt TCRs ist von zentraler Bedeutung für die Bestimmung der synaptischen 2D-K D -Werte. Nach der Formel 4 dieser Begriff ist direkt proportional zu der gemessenen FRET Ausbeute solange TCRs dient als FRET-Donoren und pMHCs als FRET-Akzeptoren. <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> mit a = TCR Belegung, C = Umrechnungsfaktor C eine Konstante ist, die auf dem FRET-System abhängt, und die verwendeten Fluorophore. Es kann experimentell wie folgt bestimmt werden. ein in eine 2D-K D nach Gleichung 5 umgewandelt, wenn derAnfangsdichte von TCR-Liganden vor der Zugabe von T-Zellen, um die Doppelschicht bekannt ist. Dies ist wegen der hohen Mobilität der SLB-Proteine ​​gebunden und auch, weil SLBs bieten ein nahezu unerschöpfliches Reservoir an Liganden 2. <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> mit [pMHC Anfangs] = Anfangsdichte von pMHC vor der Zugabe von T-Zellen Mit den Gleichungen 4 und 5 kann man nun leicht die synaptische 2D-K D zwischen TCR und pMHC. Dies wird am zuverlässigsten mit FRET-Messungen basierend auf Spender Erholung nach Akzeptor Bleichen (siehe Protokoll Abschnitt 3.1) durchgeführt. Jedoch zur Messung C die Beziehung zwischen der Intensität I FRET FRET (Hintergrund korrigiert, FRET-Donor Durchbluten und FRET-Akzeptor Queranregung) und TCR Belegung a bestimmt werden muss. Dazu werden einbenötigt, um das Verhältnis R zwischen der mittleren Fluoreszenzintensität von einzelnen TCR-assoziierten FRET Donorfluorophore (zB Cy3 oder AF555) sm weiß ich FRET-Donor und die mittlere Intensität des einzelnen Moleküls FRET Ereignisse sm I FRET. R hängt von der FRET-System in Frage, Emissionsfilter und Kamera für die Fluoreszenzdetektion eingesetzt. Der TCR Belegungsbeginn a kann dann nach Gleichung 6 direkt bestimmt werden. <img alt="Gleichung 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> mit R = sm I FRET-Donor / sm I FRET R wurde als 1,45 für den H57 scFv- Cy3 / Cy5 pMHC-Systems bestimmt zu: a = Groß Ich FRET / Groß I TCR-cy3 • 1,45 Die Beziehung zwischen dem TCR Belegung a und der FRET-Ausbeute kann durch FRET-Donor bestimmen erholeny nach dem Akzeptor-Bleichen. Hierzu werden beide Parameter gegeneinander für eine Reihe TCR Mikrocluster aufgetragen, wie in 4A .Die Steigung der linearen Anpassung gezeigt gibt die Umwandlungsfaktor C (aus Gleichung 4). Wie in 4A gezeigt, C Beträge für (a) die H57 scF V - Cy3 / Cy5 pMHC-FRET-System und (b) der aufgebrachten Mikroskop Systemkonfiguration auf 1.995. Der TCR Belegungsbeginn ein leicht wie folgt abgeleitet werden: TCR Belegung a = FRET-Ausbeute • 1.995

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td >bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf900 II</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10227402</td>
			<td>insect cell media for baculo virus production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10564038</td>
			<td>insect cell media for baculo virus expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>cells for virus production and expansion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Five Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B855-02</td>
			<td>cells for potein expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td>bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate System</td>
			<td>Pall</td>
			<td></td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate cassette 10kDa cutoff</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OS010T12</td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td >5123</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#196;kta pure 25L</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>29-0182-24</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 200 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5175-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 75 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5174-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mono Q 5/50GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5166-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5318-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column&#160;</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy5 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA25031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td>A-20346</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-20347</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >F-1221</td>
			<td>calcium-sensitive dye for cell labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >151874</td>
			<td>for dissolving fura-2 am</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10225362</td>
			<td>imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin lyophilized powder</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td>supplement for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14-4-4S antibody</td>
			<td >affimetrix eBioscience</td>
			<td >14-5980-81</td>
			<td>blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >FALCON 352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.22 &#956;m Ultrafree-MC centrifugal filter unit</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >UFC30GV0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TetraSpeck Microspheres, 0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
			<td >Life technologies</td>
			<td >T-7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for fura-2-based calcium measurements&#160;</td>
			<td >LEICA</td>
			<td >DMI4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for (single molecule) FRET measurements</td>
			<td >LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >planar supported lipid bilayers</td>
			<td ></td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640, with L-Glutamine</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >11554416</td>
			<td>T-cell media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >non-essential amino acid 100X</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SH30238.01</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >12000226</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >M6250</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse interleukin-2 recombinant protein</td>
			<td >BPS Bioscience</td>
			<td >90185-B</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Research Grade Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SV30160.03</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Origin (analysis program)</td>
			<td >OrigenLab</td>
			<td >http://www.originlab.com/</td>
			<td>non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring tcr-pmhc binding in situ using a fret-based microscopy assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Die Aufzeichnung der intrazellulären Calcium über den Fura-2 Calciumfarbstoff sowie die anschließende Zellanalyse die stimulierende Wirkung und damit Funktionalität der SLBs sind in Abbildung 4 gezeigt, um zu verifizieren. Wie deutlich wird, steigen die Calciumspiegel in T-Zellen (wie die ausgedrückt normalisierten Fura-2 340 nm / 380 nm Verhältnis zum Ausgangswert gleich 1) sofort, sobald sie auf die stimulierende SLBs begleichen. Calcium-Spiegel wieder auf das Ausgangsniveau kurz nach der Zugabe eines Antikörpers, der Blöcke pMHCs von TCR Engagement und welcher endet T-Zell-Aktivierung. Figur 6 zeigt einen typischen Versuch mit FRET-Donor-Akzeptor Erholung nach Bleichen, das verwendet wird, um FRET Ausbeuten messen und die 2D-K D -Werte berechnet dient (in 4 gezeigt). Bitte beachten Sie die Zunahme der FRET-Donor Intensität, die TCR stellt über AF555 markiert, nachdem eine schnelle und vollständige Ablation des FRET eincceptor Arten (hier: AF647 mit pMHCs zugeordnet). Außerdem erkennt man die starke Verringerung des FRET-Kanal, dh dem FRET-Akzeptor-Kanal unter FRET Donoranregung nach FRET-Akzeptor Bleichen. Die kaum sichtbaren Restsignal entspricht Spenderdurchscheinen FRET. FRET Renditen innerhalb einzelner TCR Mikrocluster oder ganze Synapsen werden berechnet auf der Grundlage der angegebenen gemessenen Intensitätswerten (6B). Figur 7 zeigt eine Bahn und Zeitablauf eines einzelnen Moleküls FRET Ereignis in zwei Zeitrahmen sichtbar. Wie oben in der Einleitung dargelegt solches Verhalten wird sowohl durch Zerfall von synaptischen TCR-pMHC-Bindung und Photobleich verursacht. Um zwischen diesen beiden Beiträge zu unterscheiden, haben die Versuchserfassungszeitrahmen zu der Dauer variiert werden, während eine konstante Lichtbleichung verbleibt, werden Änderungen in FRET Ereignis Trajektorienlänge nur durch die Bindungskinetik verursacht. Eine Quantifizierung der tracelengths, w<html> hich die Grundlage für die Berechnung der in 7 gezeigt ist off-Raten und Bleich bildet, sind in den Tabellen 1 bis 3 zur Verfügung gestellt. Bestimmung der 2D-K D s erfordert Aufzeichnung von Groß FRET Renditen für FRET-Donor markierten TCRs. Mit der Verwendung des experimentell abgeleitete Konstante C (Abbildung 4) kann ein FRET-Ausbeute für eine TCR Microcluster oder eine ganze Synapse, gemessen in die TCR umgewandelt bezugs ein, dh das Verhältnis von pMHC-Eingriff und die Gesamt TCRs (4C) . Mit bekannten pMHC Dichten in der SLB vor der Zugabe der T-Zelle vorhanden ist, können a -Werte aufgetragen, um synaptische 2D-K D -Werte (4D) zu bestimmen. On-Raten können mit dem Massenwirkungsgesetz berechnet werden (2D-k on = 2D-k off / 2D-K D) von der fest synaptischen off-Rate und 2D-KD-Werte. 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1 Schematische Darstellung der Lipiddoppelschicht-System planare Glasgestützten (SLB). (A) SLBs aus POPC (90-99%) und dem synthetischen Lipid DGS Ni-NTA (1-10%) zusammengesetzt und bilden sich spontan, wenn saubere Glasoberflächen mit kleinen unilamellaren Vesikeln (SUVs) berechnet, die aus den entsprechenden Lipiden. (B) Einmal gebildet, können solche SLBs mit löslichen Polyhistidin-markierten extrazellulären Anteile von pMHCs abgeleiteten kostimulatorischen B7-1-Proteine ​​und ICAM-1-Adhäsionsproteine, funktionalisiert werden, um als APCs für T-Zellen dienen. Für weitere Informationen über die Vorbereitung SLBs siehe Axmann et al. 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> zu 2. Förster Resonance Energy Transfer basierten Assay zu quantifizieren TCR-pMHC Bindung in situ. (A) eine Verbundstruktur aus einem TCR mit einer H57 einkettiges Fragment Eingriff eines pMHC komplexiert stellt die hierin beschriebene FRET-basierten Ansatz. Beachten Sie die kurze Entfernung von ca. 41A zwischen den beiden entsprechenden Fluorophore unterziehen FRET. Akzeptor-Stellen für die Fluorophor-Maleimide sind in grün und rot angezeigt. (B) Das Prinzip der Erfassung TCR-pMHC Wechselwirkungen in situ dargestellt. Nur scF V -Dekoriert TCRs und pMHCs (hier IE k), die spezifische Komplexe zu bilden, führen zu einer messbaren FRET-Signals. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &quot;/&gt; Abbildung 3. Die Chromatogramme der endgültigen Gelfiltrationsschritt was zu monomeren scF V s und Peptid-beladenen IE k -2x6H Moleküle. X-Achsen stellen Rückhaltevolumen in ml, Y-Achsen geben Absorption bei 280 nm in willkürlichen Einheiten (AU) . (A) H57 scF V ortspezifisch mit Alexa Fluor 555 maleimid bis S75 unterzogen, wobei nicht umgesetzte Farbstoff von dem Protein (Schritt 1.2.5) getrennt markiert. Fraktionen, die Retentionsintervall 14 bis 15 ml (gestrichelte Linien) darstellen monomeren H57 scF V markiert. (B), dh k -2x6H Moleküle mit der UV-spaltbare ANP-Abstandshalter-Peptid komplexiert war UV-bestrahlt wurden, mit ortsspezifisch Alex inkubiert 647 Maleinimid-markierten Peptids und schließlich zu S200 unterzogen, wobei das Protein aus freien Peptids (Schritt 1.1.2.4) zu trennen. Der Abstand zwischen den gestrichelten Linien enthält und richtig gefalteten monomeren pMHCs. (A, B) </strong&gt; 0,7 ml Probe wurde auf die Säule mit Beginn der rum (0 ml Punkt) aufgebracht. Gesammelten Fraktionen wurden eingeengt. Das Protein-zu-Farbstoff-Verhältnis wurde photospektrometrisch vor der Dialyse gegen PBS / 50% Glycerin bestimmt (für die Lagerung bei -20 °). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> Abbildung 4. Bestimmung 2D-K D s und 2D-k auf s. (A) Die Korrelation zwischen der FRET-Ausbeute von Geberrückgewinnung bestimmt, nachdem Akzeptor Bleichen und TCR Belegung wurde experimentell gemessen. TCR Belegung kann für einzelne TCR Mikrocluster bestimmt werden, wie in Abschnitt 4.2 erläutert. Eine lineare Anpassung der Daten wird durch die Linie angezeigt wird, gleich dem Verhältnis zwischen C TCR ist deren NeigungBelegung und die FRET-Ausbeute. C ist eine Konstante, spezifisch für den FRET-System und den Fluorophoren (hier Cy3 und Cy5) eingesetzt. In diesem Beispiel ergab 1.988. (B) FRET-Ertragsdaten wurden für die einzelnen TCR Mikrocluster ermittelt (N = 187, Temperatur = 24 ° C) durch Spenderrückgewinnung von Akzeptor-Bleichen. Zahlen unter Histogramm-Balken zeigen die obere Grenze innerhalb des Intervalls. (C) Die Umwandlung der in (B) gezeigten Daten durch Multiplizieren gemessenen FRET-Renditen mit der Konstante C bestimmt in (A). Zahlen unter Balken zeigen die obere Grenze innerhalb des Intervalls. (D) Histogramm (halblogarithmischen, base = 4), welches die Verteilung von 2D-K D s für einzelne TCR Mikrocluster gemessen. Die mediane 2D-K D wird blau angezeigt. Zahlen unter Balken zeigen die obere Grenze innerhalb des Intervalls. (E) Die in (D) gezeigt, Histogramm wurde int umgewandeltoa 2D-k auf -histogram (halblogarithmischen, Base = 4) unter Verwendung der synaptischen k off für 24 ° C (0,41 s -1). Der ermittelte Median 2D-k auf Wert wird blau angezeigt. Die Daten wurden ursprünglich in Huppa et al. 2 veröffentlicht und sind hier in einem neuen Format visualisiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> Abbildung 5. Funktionelle Validierung SLBs für T-Zellstimulation und Imaging beschäftigt. (A) TCR-transgene T-Zellblasten mit Fura-2 beladen waren mit stimulierenden SLB konfrontiert beherbergen gene pMHCs, ICAM-1 und B-7. Cellular Fura-2-Emission bei 340 nm und 380 nm angeregt sowie DIC Bilder wurden aufgezeichnet. Wie angegeben, Verhältniswerte der Emissionsintensitäten bei 34 erregt0 und 380 nm sind auf der rechten Seite angezeigt. Zugabe pMHC blockierende Antikörper 14 min in die Versuchsreihe führte zu einer Abnahme der intrazellulären Calciumspiegel vergleichbar mit derjenigen von ruhenden T-Zellen. (B) eine typische zeitliche Verlauf des durchschnittlichen Fura-2-Verhältnisse in T-Zellen in Kontakt stimulatorischen SLBs gekennzeichnet durch eine einem anfänglichen Anstieg des intrazellulären Calciums, die 2 bis 4 mal höher ist im Vergleich zu der nicht-aktivierten T-Zellen oder T-Zellen-Antigen nach der Antikörper-vermittelten Blockade beraubt. Grüne Kreise zeigen in (A) veranschaulicht den Zeitpunkten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> Abbildung 6. Bulk-FRET-Ausbeuten durch FRET-Donor Erholung nach FRET-Akzeptor Bleichen gemessen. <strOng&gt; (a) ist ein Beispiel eines typischen synaptischen FRET-Messung. Wie auf der linken und auf der Oberseite angedeutet eine Reihe von Bildern mit der Verwendung eines Emissionsstrahlteiler, die zu einem FRET-Donor und ein FRET-Akzeptor-Kanal erworben (für nähere Informationen zu Strahlteiler siehe Axmann et al 4). Der in der linken Bild DIC gezeigte Linie zeigt die Begrenzung der T-Zell-Synapse. Beachten Sie den Intensitätsverlust in der FRET-Akzeptor-Kanal als auch der Anstieg der Intensität in der FRET-Donor Kanals nach FRET Akzeptorbleichen (Schritt 4). (B) FRET-Effizienz quantifiziert für einzelne synaptischen Regionen oder für ganze Synapsen bezeichnet werden. Zur Inspektion werden die Bilder vor und nach der FRET-Akzeptor Bleichen mit dem Einsatz von zwei Suchtabellen (LUTs, grün und Physik) angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </p&gt; <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> Abbildung 7. Einzelmolekül-FRET-Ereignissen erscheinen und verschwinden insingle Schritte und sind perfekt mit einem einzigen FRET Akzeptor-Fluorophor ausgerichtet ist. Der Zeitablauf der Einzelmolekül-FRET-Event gezeigt. Bilder wurden mit einem rückseitig belichteten EMCCD Kamera erworben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> Abbildung 8. Die Bestimmung τ off = 1 / k off aus gemessenen smFRET Trajektorien. (A) Die normierten kumulativen Summen beobachtbaren FRET-Signale (von H57 scF V -AF555 abgeleitet dekoriert 5c.c7 TCR transgene T-Zell-Blasten erkennen IE &lt;sup&gt; k / K3-AF647 bei 24 ° C) für vier verschiedene Zeitverzögerungen (42 msec, 490 msec, 1,007 ms 1,989 ms) wurden als Funktion der Gesamtzahl von Beobachtungen aufgetragen. Mono-exponentielle Anpassung Funktionen führen zu entsprechend den negativen Umkehrung der Erwartungswerte &lt;n (t lag)&gt;. (B) Prognose-Werte wurden gegen die Verzögerungen t lag aufgetragen und ausgestattet mit Hilfe der Gleichung &lt;n (t lag)&gt; = τ off / {(&amp; tgr; off / &lt;n bleichen&gt;) + t lag}, um τ ergeben aus und &lt;n bleichen&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Mess TCR-pMHC Binding<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit einem FRET-Mikroskopie Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

12.2K Aufrufe.  Vienna University of Technology. This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer. 