Diese Methode kann helfen, Fragen im Immunstoffwechselfeld über den Beitrag von Immunzellen zu Adipositas-induzierten Entzündungen in Fett- und Steatohepatitis im Lebergewebe zu beantworten. Diese Techniken wurden für die Isolierung von Fett- und Leberimmunzellen in einem ernährungsinduzierten Modell der nichtalkoholischen Steatohepatitis optimiert, das durch ein unspezifisches pathogenfreies Nagetiergehäuse erreicht wird. Diese Methoden können dazu beitragen, unser Verständnis der immunologischen Mechanismen zu vertiefen, die bei der Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase beteiligt sind.
Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik neu sind, mit der Maximierung der Ausbeute von funktional lebensfähigen dissoziierten Zellen und der Einrichtung der richtigen Gating in der Durchflusszytometrie zu kämpfen haben. Um eine fettgewebe-Einzelzellsuspension zu erzeugen, sprühen Sie die Brust einer eingeschläferten Maus mit 70% Ethanol und machen Sie vorsichtig einen fünf bis sechs Zentimeter großen zentralen Schnitt durch die Integument- und Bauchwand entlang der gesamten Länge des Rippenkäfigs, um die Pleurahöhle und das Herz freizulegen. Mit einer 26-Spur-Nadel, injizieren Sie mindestens 10 Milliliter 0,9%saline Lösung in die Spitze der linken Herzkammer, und verwenden Sie eine Schere, um die Peritonealhöhle zu öffnen.
Dann sezieren Sie das epigonadale Fettgewebe und wiegen Sie es. Zerlegen Sie das Fettgewebe in einer Petrischale bei vier Grad Celsius mechanisch in feine Stücke, bevor die Gewebefragmente in ein 50-Milliliter-Konusrohr übertragen werden. Spülen Sie die Petrischale mit einem Milliliter 0,5% Rinderserumalbumin oder BSA in PBS, und fügen Sie drei Milliliter frisch zubereitete Fettgewebe-Digest-Lösung pro Gramm Fettgewebe in die Röhre.
Nach 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute fünf Milliliter 0,5%BSA in PBS hinzufügen und den Fettverdauungsgrad auf Eis legen. Trituieren Sie die Lösung mehrmals mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette und verwenden Sie einen Kolben, um die Lösung durch ein 100-Mikrometer-Sieb zu passieren. Trennen Sie die Gewebefraktionen durch Zentrifugation, und verwenden Sie eine Pipette, um die schwimmende Adipozytenfraktion zu verwerfen.
Setzen Sie das stromale Vaskuläre Zellpellet in einem Milliliter Ammoniumchlorid-Kalium oder ACK, Lysepuffer, wieder auf und stoppen Sie die Lysereaktion mit 10 Millilitern 2%fetalem Kalbserum oder FCS in PBS nach wenigen Sekunden. Dann sammeln Sie die isolierten weißen Blutkörperchen durch Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in 250 Mikroliter von 2%FCS in PBS zum Zählen. Ernten Sie die Leber in eine konische Röhre von PBS auf Eis, bevor Sie Spritzenstempel verwenden, um das Gewebe in einer Petrischale bei vier Grad Celsius mechanisch zu dissoziieren.
Übertragen Sie die sezierten Lebergewebefragmente in eine 50-Milliliter-Röhre mit 10 Milliliter warmer Leberverdauungslösung und spülen Sie die Petrischale mit drei Millilitern frischer Leberverdauungslösung ab. Nach 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute die Verdauung mit 20 Millilitern HBSS beenden und die Gewebeschlämme mehrmals mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette trituieren. Verwenden Sie einen Kolben, um die Gewebelösung durch ein 100-Mikrometer-Sieb zu passieren, und sammeln Sie die Leberzellen durch Zentrifugation.
Setzen Sie das Pellet in 20 Milliliter frischer HBSS aus, und entfernen Sie die Hepatozytenmatrix durch Zentrifugation. Sammeln Sie den Überstand für die Zentrifugation, indem Sie das Pellet in 10 Millilitern mit 33% niedriger Viskositätsdichtegradienten-Medium-Lösung in HBSS wieder aufhängen. Trennen Sie die Leberimmunzellen durch Dichtegradientzentrifugation, und setzen Sie das Leukozytenpellet in einem Milliliter ACK-Lysepuffer wieder auf.
Nach vier Minuten bei Raumtemperatur die Lyse mit 10 Millilitern HBSS stoppen und die Zellen durch ein 30-Mikrometer Porensieb in ein 15-Milliliter-Rohr für die Zentrifugation filtern. Dann setzen Sie das Pellet in 250 Mikroliter 2%FCS in PBS zum Zählen wieder aus. Für die zytometrische Analyse der isolierten Leukozytenpopulationen summieren sich bis zu dreimal 10 zu den sechs Zellen in 100 Mikrolitern von 2%FCS in PBS aus dem Gewebe von Interesse in einzelne Polystyrolfluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, oder FACS, Rohre.
Fügen Sie 10 Mikroliter Anti-CD16/CD32-Antikörper in jedes Rohr ein, um jede unspezifische Bindung für 10 Minuten auf Eis zu blockieren, gefolgt von einer Färbung mit dem entsprechenden Volumen an Antikörpergemisch und einem Mikroliter Lebensfähigkeitsfarbstoff pro Probe, um eine Diskriminierung lebender und toter Zellen zu ermöglichen. Nach 20 Minuten bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt, waschen Sie die Proben zweimal mit zwei Millilitern von 2%FCS plus PBS pro Wäsche, und Zentrifuge bei 300 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Dann setzen Sie das Pellet in frischem PBS plus FCS wieder aus.
Um die Zellen durch Durchflusszytometrie zu analysieren, verwenden Sie eine ungefärbte negative Kontrollprobe, um die Vorwärts- und Seitenstreuung einzustellen, und passen Sie die Spannungen des Durchflusszytometers an, um die lebensfähige Leukozytenpopulation zu erkennen und die Trümmer auszuschließen. Führen Sie anschließend einzelne gebeizte Kontrollproben für die mehrfarbige Kompensation aus, bevor Sie die experimentellen Proben ausführen, und sammeln Sie mindestens fünfmal 10 bis zu den vier Ereignissen pro Rohr. Exportieren Sie dann die FCS-Datendateien zur Analyse, und legen Sie die Gating-Strategie für CD45-positive Leukozyten fest, um die Identifizierung der nachfolgenden Immunzellpopulationen von Interesse zu ermöglichen.
Hier wird eine repräsentative Gating-Strategie für T-Zell-Subpopulationen einschließlich doppelter Diskriminierung und Lebensfähigkeitsfärbung in murinem Perigonadalfett gezeigt. CD45-positive Leukozyten werden zuerst für CD4 und CD8 und anschließend für CD44- und CD62-Ligand enden, um zwischen naiven, zentralen Speicher-, Effektorspeicher- und Effektor-T-Zellen zu unterscheiden. CD44-positive Zellen werden dann weiter mit CD127, Killerzell-Lektin-ähnlichem Rezeptor G1 und programmiertem Tod-1 charakterisiert.
Hier wird die Gating-Strategie zur Analyse von B-Zellen, Granulozyten, natürlichen Killerzellen, Makrophagen und dendritischen Zellen gezeigt. Ein höherer Prozentsatz von Effektorspeicher CD4-positive und CD8-positive Zellen können in fettreichen Diätmäusen nachgewiesen werden, die unter Nicht-SPF-Bedingungen untergebracht sind, während intrahepatische naive CD4-positive und CD8-positive T-Zellen bei diesen Tieren deutlich niedriger sind als SPF-Fett-Diätmäuse in Woche sieben. Schwere Steatose, einschließlich einer Zunahme von großen Lipidtröpfchen, die zu makrovesikulärer Steatose, lobularer Entzündung, hepatozellulärer Ballonung und zerstörter lobularer Struktur führen, findet sich in fettreichen, fettexponierten Mäusen, während nur einige SPF-Mäuse eine leichte Fettansammlung in der Leber zeigen.
Darüber hinaus ist der Anteil der natürlichen Killerzellen im perigonadalen Fettgewebe von fettreichen, fettexponierten Mäusen höher, während fettreiche SPF-Mäuse höhere Anteile an dendritischen Zellen zeigten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zellen auf Eis und im Dunkeln zu halten, sofern nicht anders angegeben. Sie sollten jetzt ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einzellige Suspensionen richtig vorbereiten und wie Maninadipose und Lebergewebe für Durchflusszytometrie-Experimente isoliert werden kann.
