Das Protokoll veranschaulicht, wie eine In-vivo-Tiefengewebe-Drei-Photonen-Mikroskopie im Gehirn von Mäusen und bei erwachsenen Zebrafischen durchgeführt werden kann. Zwei wichtige Modellsysteme in den Life Sciences. Die langwellige Drei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht in vivo eine hochauflösende Bildgebung intakter Gewebe oder Organe in Tiefen, die durch Zwei-Photonen-Mikroskopie nicht zugänglich sind.
Diese Technik kann uns helfen, die zugrunde liegenden Mechanismen neurologischer Erkrankungen wie Alzheimer und Autismus zu verstehen, bei denen ein vollständiges Verständnis der Auswirkungen der Krankheit auf das Gehirn fehlt. Kibaek Choe, der Postdoktorand aus unserem Labor, wird das Verfahren zur Bildgebung des Gehirns der Maus demonstrieren, und Kristine Kolkman, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin des Fetcho Research Laboratory, wird das Verfahren zur Bildgebung des Zebrafischgehirns demonstrieren. Schalten Sie zunächst den Laser ein und stellen Sie die mittlere Wellenlänge des Leerlaufausgangs des nicht-kollinearen optischen parametrischen Verstärkers auf 1.300 oder 1.700 Nanometer ein, platzieren Sie dann Pulskompressoren auf dem Lichtweg, um den Femtosekundenlaser vorzuchirpen und die Pulsdauer für die Drei-Photonen-Bildgebung zu optimieren.
Stellen Sie den Winkel zwischen der Siliziumplatte und dem Laserpfad auf den Brewster-Winkel ein, um die Laserdurchlässigkeit zu maximieren, und drehen Sie dann die Siliziumplatte, um den Brewster-Winkel zu erreichen, indem Sie die Reflexion minimieren. Als nächstes platzieren Sie Flipperspiegel, um bequem zwischen den 1.300- und 1.700-Nanometer-Strahllinien zu wechseln. Platzieren Sie eine halbe Wellenplatte, die auf einer Rotationsstufe montiert ist, und einen polarisierenden Strahlteiler, um die Intensität des Lasers zu steuern, und platzieren Sie dann einen Strahlblocker im Reflexionspfad des Strahlteilers.
Bereiten Sie eine Petrischale mit 0,5 Zentimetern 2% Agar mit hohem Schmelzpunkt zu. Sobald der Agar abgekühlt und erstarrt ist, schneiden Sie ein rechteckiges Loch in den Agar, das länger und etwas breiter ist als der Fisch. Befestigen Sie mit Wachs dünne Schläuche an der Petrischale mit einem Ende im Rechteck und einem Schlauch mit größerem Durchmesser am Rand der Petrischale.
Als nächstes betäuben Sie den Fisch, indem Sie ihn in eine 0,2 Milligramm pro Milliliter Tricainlösung geben, dann den betäubten Fisch auf seine Seite auf einen nassen Schwamm legen, dann mit einer Mikrospritze, retro-orbital 3 Mikroliter Pancuroniumbromid injizieren, um den Fisch zu lähmen, und legen Sie ihn kurz in Hanks Lösung, um sicherzustellen, dass er vollständig gelähmt ist. Als nächstes legen Sie den Fisch dorsal-side nach oben in die Petrischale mit dem Kopf zum Schlauch, dann mit einer Pinzette, öffnen Sie vorsichtig das Maul des Fisches und schieben Sie den Schlauch in den Mund. Schieben Sie den Fisch vorsichtig in Richtung des Schlauches, so dass sich der Schlauch an der Rückseite des Mauls des Fisches befindet.
Trocknen Sie das Agar schnell, aber vorsichtig um den Fisch herum und entfernen Sie das Wasser auf dem Fisch. Tauchen Sie ein kleines Stück Laborgewebe in Laborkleber und legen Sie das Gewebe auf beiden Seiten des Fisches auf das Agar und über den Rücken des Fisches mit den Kiemen. Als nächstes betäuben Sie die Haut des Fisches, indem Sie einen kleinen Tropfen Bupivacain direkt auf die Oberfläche des Kopfes geben und dann die Petrischale mit dem Fisch zum Mikroskop bringen.
Füllen Sie die Schale mit Wasser aus der Fischanlage und schließen Sie den Schlauch an eine Wasserpumpe an, um Systemwasser in das Maul des Fisches zu pumpen. Stellen Sie sicher, dass das Wasser mit einem Bubbler angereichert und mit einer Aquarienheizung auf 30 Grad Celsius erwärmt wird. Platzieren Sie für die Bildgebung ein Objektiv mit geringer Vergrößerung auf dem Drei-Photonen-Mikroskop, legen Sie dann die Petrischale mit den Fischen und den Röhren unter das Mikroskop und verwenden Sie eine LED-Lichtquelle, um die Petrischale zu beleuchten.
Öffnen Sie in der Bildaufnahmesoftware den Kameramodus, klicken Sie auf Live, wählen Sie Kanal A auf der rechten Seite des Bildschirms und passen Sie die Histogrammeinstellungen an, um das Bild klar zu sehen. Nachdem Sie die Motoreinstellung am Motorregler auf Basis eingestellt haben, senken Sie das Objektiv ab, bis der Fisch sichtbar ist. Platzieren Sie die Mitte des Fischkopfes in der Mitte des Sichtfeldes und bewegen Sie dann das Ziel nach oben und weg vom Kopf des Fisches.
Ersetzen Sie das Objektivobjektiv mit geringer Vergrößerung durch das Objektivobjektiv mit hoher numerischer Blende für die Aufnahme von drei Photonen und bewegen Sie es dann nahe an den Kopf des Fisches. Setzen Sie die Achswerte aller Motoren auf Null. Senken Sie die Objektivlinse langsam ab, um sicherzustellen, dass das Objektiv den Kopf nicht physisch berührt.
Hören Sie in der CCD-Kamerasoftware auf, das Objektiv zu bewegen, wenn die Oberseite des Kopfes sichtbar ist, und setzen Sie die Positionen X, Y und Z auf Null. Schalten Sie die LED-Lichtquelle aus und schließen Sie den dunklen Vorhang um das System, stellen Sie dann die Bilderfassungssoftware für die Drei-Photonen-Bildgebung in den Multiphotonen-GG-Modus ein und stellen Sie die Leistung unter der Objektivlinse auf weniger als ein Milliwatt ein. Klicken Sie in der Bilderfassungssoftware auf die Schaltfläche Live.
Öffnen Sie PMT-Kanäle und passen Sie die PMT-Verstärkung und den Hintergrundpegel nach Bedarf an. Bewegen Sie sich langsam die Objektivlinse hinauf, um die Oberfläche des Kopfes zu lokalisieren, indem Sie den THG-Kanal von den großen Blutgefäßen und der Fensterglasoberfläche aus überwachen. Nachdem Sie die Objektivlinse in die Nähe des Fensters bewegt haben, wenden Sie Wasser zwischen dem Objektiv und dem Schädelfenster an und stellen Sie dann die Achsenwerte aller Motoren auf Null ein.
Klicken Sie in der Bilderfassungssoftware auf die Schaltfläche Live. Öffnen Sie PMT-Kanäle und passen Sie die PMT-Verstärkung und das Hintergrundniveau nach Bedarf an, und bewegen Sie sich dann langsam die Objektivlinse nach oben, um die Oberfläche des Deckschlupfes zu lokalisieren, indem Sie den THG-Kanal von den großen Blutgefäßen und der Fensterglasoberfläche aus überwachen. Passen Sie bei Bedarf die Fensterausrichtung an und setzen Sie dann die Motoren auf Null, um die Oberfläche des Gehirns zu definieren.
Führen Sie eine Bildgebung durch und passen Sie die Leistungsstufe entsprechend der Abbildungstiefe an. Hochauflösende, nicht-invasive und tiefe Bildgebung von genetisch markierten Neuronen im erwachsenen Zebrafischgehirn wird mittels Drei-Photonen-Mikroskopie erreicht. Auch die Verteilung der Zellschichten im optischen Tectum und Kleinhirn kann beobachtet werden.
Die Kamerafunktion des Mikroskops wurde verwendet, um den Fisch zu lokalisieren. Der Schädel ist im THG-Kanal zu sehen, der hilft, durch das Gehirn zu navigieren und die obere Oberfläche zu finden. Neuronen sind mit einem hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis tief im erwachsenen Gehirn unterscheidbar.
Mehrfarbige Drei-Photonen-Bilder von GCaMP6s-markierten Neuronen und Texas Red-markierten Blutgefäßen zusammen mit THG-Signalen im erwachsenen Mäusegehirn sind hier zu sehen. Mit der Setup-Optimierung gelang es, kontrastreiche Bilder bis zu 1,2 Millimeter von der Gehirnoberfläche in der CA1-Hippocampus-Region zu erhalten. Calciumaktivitätsspuren von GCaMP6s-markierten Neuronen in einer Tiefe von 750 Mikrometern für eine 10-minütige Aufnahmesitzung zeigten eine hohe Aufnahmetreue.
Dieses Setup kann helfen, neuronale Aktivität zu visualisieren, um die Gehirnfunktion zu verstehen. Es kann auch verwendet werden, um die Zellbewegung innerhalb des biologischen Gewebes zu verfolgen, um verschiedene biologische Systeme zu verstehen. Darüber hinaus kann auch die Blutflussgeschwindigkeit gemessen werden, um die Gesundheit des Tieres zu überwachen.
