This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

HINWEIS: Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der institutionellen Ethikkommission der Animal Care in Genf, die Schweiz und die kantonalen Veterinäramt durchgeführt. Zulassungsnummer GE / 63/14. 1. Herstellung einer Einzelzellsuspension aus dem Knochenmark <ol><li> Sacrifice Maus (8-12 Wochen alt) durch Genickbruch. Sterilisieren Sie die Hinterbeine mit 70% Ethanol. Entfernen Sie die Haut vor den Hinterbeinen. </li><li> Sezieren Maus Oberschenkelknochen und Schienbeinknochen und Gewebe zu entfernen von den Beinen mit einem Skalpell. Beine mit 90% Ethanol und Ort Spülen in eine Kulturschale mit PBS gefüllt. </li><li> Unter dem Kultur Kapuze, sauberen Tuch ab Oberschenkelknochen und Schienbeine mit einem Skalpell und separatem am Kniegelenk. Abgeschnitten jedes Ende der Knochen. </li><li> Flush Knochenmark aus jedem Knochen Verwendung einer 23G Nadel und einer 1 ml Spritze mit Präparationsmedium (Phenolrot-freiem DMEM / F12, 1% Rattenserum) gefüllt ist, in einen 50 ml Schneckenrohr. Stören Zellaggregate durch zart Passage durch die 23G needle und eine 1 ml-Spritze. Bringen Gesamtvolumen auf 25 ml mit Präparationsmedium. </li><li> Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C. Überstand verwerfen. Pellet in 1 ml Lyse der roten Blutkörperchen RBLC Puffer (8,3 g NH 4 Cl, 1 g NaHCO 3, 1 ml EDTA (100 mM), vollständig auf 1 l mit destilliertem Wasser, das Filter von 0,22 um) in einem 15 ml Schraubenrohr. Inkubieren Sie 30 Sekunden auf Eis. </li><li> 10 ml Herstellungsmedium und Zentrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C. Überstand verwerfen und resuspendieren in 2 ml Herstellungsmedium. </li></ol> 2. Neutrophilen-Anreicherung durch negative Selektion <ol><li> Fügen Sie 150 ul Maus-Neutrophilen-Anreicherungscocktail (Zellisolation Plattform-Kit wie EasySep). Mischen und Inkubation auf Eis für 10 min. </li><li> 10 ml Phenolrot-freiem DMEM. Kehren Sie sofort und Zentrifuge 250 xg, 3 min, 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen. Pellet in 1,75 ml Herstellungsmedium in 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Fügen Sie 250 ul Biotin Auswahl Cocktail. Mischen und Inkubation auf Eis für 10 min. </li><li> Mischen Sie den magnetischen Partikeln (aus der Zellisolation Plattform-Kit) für 30 Sekunden, um Partikel zu resuspendieren. Gib 500 &amp; mgr; l magnetischen Teilchen an Zellen in Suspension. Mischen und Inkubation auf Eis für 10 min. </li><li> Das Röhrchen wird in den Magneten. 3 min warten. </li><li> Kehren Sie die Magneten auf eine neue 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen, um die gewünschten unmarkierten Zellen zu sammeln. Nehmen Sie nicht den letzten Tropfen hängen in der Röhre. Unerwünschte Zellen wird in dem Rohr innerhalb des Magneten bleibt. Entsorgen Sie diesen Schlauch in einem biohazard Abfälle. </li><li> Setzen Sie die neue Röhre in den Magneten. 3 min warten. </li><li> Kehren Sie die Magneten auf ein neues 15 ml Schraubenrohr, um die gewünschten unmarkierten Zellen zu sammeln. Nehmen Sie nicht den letzten Tropfen hängen in der Röhre. </li><li> Komplette Volumen auf 5 ml mit Phenolrot-freiem DMEM. </li></ol> 3. Kennzeichnung von Neutrophilen <ol><li> Mit 0,5 ul einer orangen Farbstoff wie Zell Tracker Orange (Arbeitskonzentration1 &amp; mgr; M, CMRA - Chlormethyl-Rodol-Acetat, Lager 10 mM in DMSO). Inkubieren 2 min bei 37 ° C. </li><li> In 2,5 ml Herstellungsmedium. Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen. Pellet in 1 ml Herstellungsmedium in einem 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Einen aliquoten mit Zählkammer zählen. </li><li> Inkubiere 5 min bei 37 ° C. Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen. Pellet in 1 ml PBS. Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C zu waschen. </li><li> Überstand verwerfen. Pellet als 10x10 6 Zellen pro 100 &amp; mgr; l PBS. Halten Sie auf Eis, bis iv Injektion. HINWEIS: Die Zellen werden iv injiziert, so schnell wie möglich. 6-12x10 6 Neutrophile / Maus sind in der Regel erhalten. </li></ol> 4. Maus Vorbereitung Intravitalmikroskopie HINWEIS:.. Schritt 4.1) und 4.2) sollte zu Beginn des Experiments durchgeführt, um längere Wartezeit von markierten Neutrophilen zu vermeiden ice. <ol><li> Wiegen Sie die CX 3 CR1 GFP-Maus (8-12 Wochen alt). </li><li> Vorzubereiten 800 ul von Anästhetika (Ketamin 60 mg / kg, Xylazin 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg in PBS). </li><li> Anesthetize Maus. Injektion ip mit 200 &amp; mgr; l / 20 g Maus. Steuer Anästhesie durch Zehen Kneifen und durch Überprüfung der Atemfrequenz. </li><li> Injizieren Neutrophilen (10x10 &amp; sup6; Zellen in 100 ul PBS) intravenös über die laterale Schwanzvene oder den retro-orbitalen Sinus, auf den Komfort des Experimentators. </li><li> Setzen Sie die Maus auf Heizkissen und die Augen mit Augen Gel schützen. </li><li> Ein Deckglas (35 mm Durchmesser) wird in einem 10 cm Gewebekulturschale, die einen Durchmesser von 30 mm Loch setzen. Verwendung Öl wird der Gewebekulturschale in Kontakt mit dem Deckglas zu erhalten. </li><li> Einzuschneiden Bauchhaut mit einer Schere, um das Bauchfell aus. Einzuschneiden Peritoneum mit einer Schere auf Darm freizulegen. </li><li> Zugeben von 200 &amp; mgr; l PBS (auf 37 ° C vorgewärmt) in die peritoneal Höhle. Nehmen Sie die Maus in der Hand und drehen Sie sie nach unten, so dass der Darm steigt aus der Bauchhöhle mit einem sanften Druck. Platzieren Sie die Maus in der Gewebekulturschale. </li><li> Deroll vorsichtig den Darm mit sterilisierten Wattestäbchen auf das Deckglas, um die Mesenterialgefäße aussetzen. </li><li> Schneiden Sie Papiertaschentücher in Bands und benetzen sie mit 37 ° C erhitzt PBS. Immobilisieren den Darm mit den Stücken von Papiertaschentüchern, um die Bewegungen von Peristaltik resultierenden verringern. </li><li> Legen Sie die Gewebekulturschale und die Maus in den 37 ° C temperiert Kammer auf die maßgeschneiderten Fach Stufe der inversen Mikroskop. Einführung einer Spritze mit Betäubungsmittel sc in das Hinterbein. HINWEIS: Zusätzlich kann die Maus Sauerstoff (0,5 L / min) mit einer Maske erhalten. </li><li> Kontroll-Maus für die Anästhesie durch Zehen kneifen und die Kontrolle der Atemfrequenz alle 30 min. Bei Bedarf liefern einen Schub von Anästhetika (20 ul) auf die Anästhesie richtig pflegen. NICHTE: Das Trocknen des Gefäßsystems zu vermeiden. Daher ist seine Feuchtigkeit durch regelmäßige Benetzung der verwendet wird, um den Darm mit 37 ° C wärmten PBS immobilisieren Papiertaschentücher gehalten. </li></ol> 5. Messung der Neutrophilen und Monozyten Verhalten in Entzündete Gefäße in vivo unter Verwendung von Intravitalmikroskopie <ol><li> Set Laser 488- und 561- auf dem niedrigsten Leistungs notwendig, laserinduzierte Phototoxizität zu vermeiden. In unseren Versuchen ist es niedriger als 0,5%. Intensität der GFP in Monozyten und orangen Farbstoff in Neutrophilen ist so hell, dass in der Regel 0,3% ist genug. ANMERKUNG: Dies entspricht einer Laserleistung von 0,15 bis 0,25 mW mit unserem System. </li><li> Erwerben Sie Bilder von 512 x 512 Pixeln (dh 635 &amp; mgr; m) in 2,2 sec mit einem offenen Lochblende unter Verwendung der 20X Trockenziel der inversen Mikroskop. Verwenden Sie einen z-Tiefe zwischen 10 bis 20 um, die eine ausreichende Signal mit den niedrigen Laserleistungen gewährleistet. HINWEIS: Wir in der Regel führen Experimente mit einem z-Tiefe zwischen 12 und 1656; m. Im Falle der dargestellten Zahlen und Filme, die z-Tiefe 20 um. Phasenkontrast ermöglicht die Identifizierung von endothelialen Wandungen und Abbilden auf Mesenterialvenen geführt. Seit patrouillieren Zellen bewegen ganz langsam mit einer Geschwindigkeit von 5 bis 10 &amp; mgr; m / min 6, Aufzeichnung eines Interessengebiet alle 20 sec ist zufriedenstellend. Mit den beschriebenen Einstellungen, ermöglicht es dem Motortisch die Aufnahme von bis zu 7 Interessengebieten gleichzeitig. </li><li> Platzieren Sie die Maus und die Mesenterialgefäße in der Thermostatkammer des Mikroskops werden es ihnen ermöglichen, von der Vorbereitung für 30 Minuten vor dem Erwerb des ersten Films zu erholen. Während dieser Zeit, wählen Sie mehrere Felder in der Umgebung. Konzentrieren sich auf die luminale Oberfläche des Behälters in der Nähe des Ziels. Falls erforderlich, die Vorteile der leichten Autofluoreszenz des Endothels, um den Fokus einzustellen. HINWEIS: Chirurgie während der Maus Vorbereitung etwas betont die Endothel. Folglich rollt von Neutrophilen und/ oder Monozyten in den ersten 15 Minuten nach der Zubereitung der Maus beobachtet werden. </li><li> Nehmen Sie einen ersten Film für 30 min unter stationären Bedingungen, ein Bild alle 20 sec. Hinweis: Die Software übernimmt jedes Interessengebiet in 2,2 s und die Motortisch fährt automatisch von einem Feld zum anderen. Es geht während der 30 min der Aufzeichnungsfilm zurück in die erste Position innerhalb von 20 sec. </li><li> Zur Entzündung der Blutgefäße zu initiieren, einen Tropfen von 20 ul PBS, das 100 ug TLR2 / TLR1 Agonist Pam3CSK4 12 direkt auf die abgebildeten Gefäße. </li><li> Steuern Sie den Fokus für jedes Feld von Interesse. Hinweis: Im Verlauf der Übernahme, es gibt immer geringfügige Änderungen des Fokus auf der z-Achse. Trotz der 10-20 um z-Tiefe kann dies zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität führen. Daher manuell jedes Interessengebiet am Ende jedes Films zu konzentrieren, wenn nötig. Nehmen Sie die Videos für 30 Minuten-Zeiträumen und bis zu 3 h auftal nach Beginn der Entzündung. </li><li> Am Ende des Experiments zu opfern anästhesierten Maus durch zervikale Dislokation. </li></ol> 6. Generierung von Filmdateien und Verfolgung von Leukozyten HINWEIS: Die Nikon Erfassungssoftware erzeugt .nd2-Dateien, aber die folgende Vorgehensweise wäre ähnlich mit anderer Software und Marken sein. <ol><li> Export-Dateien als TIFF-Serie. </li><li> Zum ImageJ Software <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">(http://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> Importieren Sie das tiff-Serie. Jeder Kanal als eine andere Datei. </li><li> Tragen Sie eine Medianfilter mit einem Radius von 2,0 Pixel für den grünen und roten Kanälen, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren (Process&gt; Filter&gt; Median ...). </li><li> Dateien zu konvertieren in binäre (Process&gt; Binary&gt; Make Binary). Kann die Software den Schwellenwert für jedes Bild zu berechnen. </li><li> Merge-Kanälen zu einem Bild-Serie (Bild&gt; Farbe&gt; Merge Kanäle ...). Wählen Sie die Monozyten im green-Kanal, die Neutrophilen im roten Kanal und das durchgelassene Licht in der Grau Kanals. </li><li> Konvertieren gestapelten Bildern in RGB-Farben (Bild&gt; Farbe&gt; Stapeln zu RGB). </li><li> Datei speichern unter .avi </li><li> Die Daten werden importiert und in Imaris Software (Bitplane) zusammengestellt. Bewegungen von Monozyten und Neutrophile werden dann mit Hilfe der Spot-Tracking-Wizard verfolgt. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaching+multiple+barriers:+leukocyte+motility+through+venular+walls+and+the+interstitium.">Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues.">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41, 694-707 (2014).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.+Intravital+microscopic+investigation+of+leukocyte+interactions+with+the+blood+vessel+wall.">Chapter 11. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nr4a1-dependent+Ly6C(low)+monocytes+monitor+endothelial+cells+and+orchestrate+their+disposal.">Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.</a> Cell. 153, 362-375 (2013).</li><li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo.">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo.">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li><li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation.">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Die in dieser Handschrift beschriebenen Methoden bieten einen konsistenten Ansatz für Monozyten und Neutrophilen Verhalten effizient studieren in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Erkrankungen. Der entscheidende Schritt der Herstellung ist die Immobilisierung des Darms mit PBS-befeuchtete Tücher. Wenn sie richtig durchgeführt wird, werden Mesenterialgefäße schön auf dem Deckglas für die Bildaufnahme ausgesetzt ist. Dies ermöglicht die Auswahl von mehreren Bereich...

<html> Neutrophilen und Monozyten sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die kontinuierlich im Blut zirkulieren. Nach Verletzung oder Infektion, Entzündungssignale induzieren Leukozyten-Diapedese in beschädigte und infizierten Geweben, die hierin Initiieren eine zelluläre Immunantwort 1-3. Die Schnelligkeit der Mobilisierung von Leukozyten bestimmt das positive Ergebnis der Immunantworten. Diese komplizierte Prozesse stützen sich auf spezifische Moleküle (zB Selectine, Endothel-gebundenen Chemokine) auf der entzündeten Endothel vorhanden, die für die Einrichtung von Klebe Kontakte zwischen zirkulierenden Leukozyten und dem Endothel 1-3 .Um Erkenntnisse über die Moleküle in der Leukozyten beteiligt Hilfe bekommen Einstellungskaskade ist es wichtig, um die Kinetik der Zellrekrutierung zu visualisieren und das Verhalten der einzelnen Zelle / Population verfolgen. Eine wirksame Methode beinhaltet Intravitalmikroskopie an transgenen Mäusen, fluoreszierende Proteine ​​in Zellen von Interesse. Inhalt &quot;&gt; Bis heute wurden mehrere Ansätze mit Intravitalmikroskopie, um Bild entwickelt das Gefäßsystem 4,5. So wurde beispielsweise bildgebende Ohr Dermis Gefäßsystem oder Mesenterialvenen von Intravital konfokale Mikroskopie verwendet, um das Verhalten der Mäuse-Patrouillen Ly6C niedrigen Monozyten und menschliche identifizieren CD14 dim CD16 + Monozyten auf der luminalen Seite der Blutgefäße unter stationären Bedingungen 6-8. Die Maus Cremaster Gefäßmodell wird häufig verwendet, um das Verhalten von Neutrophilen oder entzündlichen Ly6C Hoch Monozyten unter entzündlichen oder ischämischen Bedingungen in transgenen Mäusen zu überwachen. In der Fall wird Cremaster über intrascrotal Injektion von IL1β, CCL2, TNFß oder fMLP stimuliert. Nach 2-4 Stunden, Gewebe werden dann chirurgisch nach außen verlagert und durch Intravitalmikroskopie 9-11 analysiert konfokalen. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren, um Monozyten und Neutrophile gleichzeitig mit jedem Monitorinvertierten Fluoreszenz konfokalen Mikroskop. Außerdem Details unserer Methode zur Darstellung von demselben Schiff vor (Beharrungszustand) und nach Entzündungen und wie man die Kinetik der Rekrutierung von Leukozyten zu folgen. Zu diesem Zweck verwenden wir die CX 3 CR1 gfp / wt-Maus, deren Monozyten exprimieren eGFP, IV mit einem orangen Farbstoff-markierten Maus-Neutrophilen injiziert. Unter Verwendung eines invertierten konfokalen Mikroskop ist es möglich, (1) zu verfolgen und zu analysieren, die Patrouillen Ly6C niedrigen Monozyten unter stationären Bedingungen und (2), um die Einstellung beider Monozyten und Neutrophilen im gleichen Gefäß nach dem lokale Entzündung zu folgen. Hier schaffen wir die entzündlichen Erkrankungen mit Hilfe der TLR2 / TLR1 Agonist Pam3CSK4 12. Darüber hinaus können solche Bildern dienen, die die Rolle von spezifischen Molekülen von Interesse in den verschiedenen Schritten der Leukozytenrekrutierung Kaskade bestimmen, ob auf bestimmten Knock-out-Mäusen oder in Gegenwart eines blockierenden Antikörpern 6,9,13 geführt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tubes&#160;</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CFI Plan Apochromat 0.45&#160;&#160; DT:4mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75&#160;&#160; DT:1mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Orange CMRA Dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>19762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil Type A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>any viscous oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Life Box Temperature Control System</td>
			<td>Life Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R</td>
			<td>inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol red free DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>any phenol red free medium is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAM3CSK4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>reconstitute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture dish 100</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging neutrophils and monocytes in mesenteric veins by intravital microscopy on anaesthetized mice in real time

Effiziente Immunantwort ist abhängig schnelle Mobilisierung von Blut Leukozyten an den Ort der Infektion oder Verletzung. Untersuchung Leukozytenmigration in vivo ist entscheidend für das Verständnis der molekularen Basis der Leukozyten transendotheliale Migration und Interaktion mit Gefäßendothel. Ein leistungsfähiger Ansatz beinhaltet Intravitalmikroskopie an transgenen Mäusen, fluoreszierende Proteine ​​in Zellen von Interesse. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Bildgebung Monozyten und Neutrophilen im CX 3 CR1 gfp / wt-Maus iv mit orangefarbenen Farbstoff markierten Neutrophilen mit einem invertierten konfokalen Mikroskop injiziert. Zeitraffer-Filme gesammelt von 30 Minuten bis zu mehreren Stunden der Bildgebung ermöglicht die Analyse von Leukozyten-Verhalten in Mesenterialvenen unter beiden stationären und entzündlichen Erkrankungen. Wir beschreiben auch die Schritte, um vor Ort zu induzieren Entzündung der Blutgefäße mit TLR2 / TLR1 Agonist Pam3SK4 und Überwachung der subsequent Rekrutierung von Neutrophilen und Monozyten. Die vorgestellte Technik kann auch verwendet werden, um andere Populationen von Leukozyten zu überwachen und zu untersuchen, Moleküle mit anderen Reizen oder transgenen Mäusen in Leukozytenrekrutierung oder Menschenhandel in Verbindung gebracht werden.

Das Manuskript beschreibt ein optimiertes Protokoll einfach das Verhalten von Monozyten und Neutrophilen in den Mesenterialvenen der narkotisierten Mäusen in Echtzeit überwachen. Die Verwendung eines 37 ° C-thermostatisierten Kammer ist obligatorisch, um die Temperatur der Maus erhalten und auch aufgrund der temperaturabhängigen Bewegung der Leukozyten. Vorbereitung der Maus ist in Abbildung dargestellt 1. Abbildung 2 zeigt die ganze Fläche unter dem Mikroskop zu sehen. Durchlicht ...

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Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

imaging-neutrophils-monocytes-mesenteric-veins-intravital-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K Aufrufe.  University of Geneva. We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Serie: Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Studieren Wechselwirkungen von<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Mit Neutrophilen durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie Zeitraffer

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The current protocol represents a practical and reproducible method to visualize the leukocyte endothelium interaction leading to leukocyte recruitment in skeletal muscle derived tissue within the intact organism of the mouse. The model is applicable to all fields of research that focus on granulocyte activation and their role in disease.
We provide a step by step protocol to guide through the method and to highlight potential pitfalls and technical difficulties. The protocol covers the following aspects: experimental settings and required material, anesthesia of the mouse, dissection of the cremaster muscle as well as tracheal and carotid cannulation, IVM recordings and offline analysis. Data formats like adherent leukocytes, rolling flux (RF) and rolling flux fraction (RFF) are explained in detail and appropriate applications are discussed. Representative results from dystrophin deficient mdx mice are provided in the results section.
IVM is a powerful tool to assess leukocyte recruitment in an in vivo setting; however, delineating for example endothelial and leukocyte function may require a combination with ex vivo setups like flow chamber experiments. Furthermore, the genetic background of animals of interest may greatly influence baseline recruitment, requiring individual fine tuning of the protocol provided. Despite its limitations, IVM may serve as a platform to readily translate in vitro findings into a living vertebrate organism.

Here, we show how to perform intravital microscopy on post-capillary venules of the mouse cremaster muscle. Commonly applied to different models of inflammation and sepsis, particularly those induced by chemokines and cytokines, we highlight its relevance in the study of muscolopathies involving exaggerated muscular leukocyte infiltration.

Leukozyten-Infiltration von Cremaster-Muskeln bei Mäusen bewertet durch Intravital-Mikroskopie

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...