Die Methode, die wir heute demonstrieren werden, bietet eine Hochdurchsatzlösung zur Bewertung der Serokonversion von Antikörpern, die entweder mit COVID-19-Infektionen assoziiert sind, oder zur Impfung für Routineanalysen. Interessanterweise ermöglicht uns dieser Ansatz, mehrere Epitope auf demselben Analyten zu bewerten. Dies hat zahlreiche Anwendungen in den biologischen Wissenschaften, einschließlich Zellsignalisierungsstudien und der Überwachung von Immunantworten.
Diese Technik wird Ihnen heute Dr. Imad Tarhoni, einem Postdoktoranden in meinem Labor, demonstrieren. Wählen Sie zunächst drei verschiedene Durchstechflaschen der magnetischen Mikrosphären mit eindeutigen Perlenregionen aus und zeichnen Sie die Perlen-ID und die Chargeninformationen für jedes verwendete Fläschchen auf. Dann wirbeln Sie den ausgewählten Mikrosphärenstock für 60 Sekunden und beschallen Sie ihn für fünf Minuten.
Übertragen Sie 1,0 mal 10 auf die sechs Perlen zu einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Proteinbindung und führen Sie das Rohr in einen Magnetabscheider ein. , um die Trennung für 60 Sekunden zu ermöglichen. Wenn sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Perlenpellet zu stören.
Entfernen Sie das Rohr vom Magnetabscheider und suspendieren Sie die Perlen dann mit 100 Mikrolitern HPLC-Wasser und Wirbel für 30 Sekunden. Setzen Sie das Rohr erneut für 60 Sekunden wieder in den Magnetabscheider und entfernen Sie anschließend den Überstand. Wiederholen Sie das Waschprotokoll zweimal.
Entfernen Sie nach der letzten Wäsche das Rohr aus dem Magnetabscheider und suspendieren Sie die gewaschenen Mikrokugeln in 90 Mikrolitern Aktivierungspuffer, pH 6,2, durch Wirbel für 30 Sekunden. Als nächstes behandeln Sie die Mikrosphären nacheinander mit 10 Mikrolitern von 50 Milligramm pro Milliliter Anhydroxysulfosuccinamid und 10 Mikroliter von 50 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung durch Vortex für 10 Sekunden. Später inkubieren Sie die Mikrosphären für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit einem sanften Wirbel alle 10 Minuten.
Nach der Inkubation waschen Sie die Mikrokügelchen zweimal mit 50-millimolärem MES oder Kopplungspuffer, pH 5,0, wie zuvor beschrieben. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal. Sobald dies erledigt ist, entfernen Sie das Rohr aus dem Magnetabscheider und suspendieren Sie die Perlen mit 100 Mikrolitern Kopplungspuffer im Wirbel für 30 Sekunden, gefolgt von der sofortigen Zugabe der gewünschten Proteinmenge in die Röhre.
Bringen Sie das Gesamtvolumen mit Kopplungspuffer auf 150 Mikroliter und mischen Sie die Reaktion durch Vortex für 30 Sekunden. Dann inkubieren Sie das Rohr für zwei Stunden durch Rotation bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation waschen Sie die Mikrosphären zweimal mit PBS-Abschreckpuffer und suspendieren Sie die gewaschenen Mikrosphären in 100 Mikrolitern Abschreckpuffer, der 0,05% Natriumazid enthält, im Wirbel für 30 Sekunden.
Zählen Sie die Anzahl der wiedergewonnenen Mikrosphären mit einem automatisierten Zellzähler und zeichnen Sie die beobachtete Perlenkonzentration auf. Für die Assay-Leistung suspendieren Sie die gekoppelten Mikrosphären 30 Sekunden lang per Wirbel und beschallen Sie für 60 bis 90 Sekunden. Entfernen Sie dann die benötigte Menge jedes Perlenkolloids aus dem jeweiligen Röhrchen und kombinieren Sie die Perlenkolloide in einem neuen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Als nächstes stecken Sie das Rohr in einen Magnetabscheider und lassen Sie die Trennung für 60 Sekunden einwirken. Wenn sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie den Überstand, ohne das Perlenpellet zu stören. Nachdem Sie die Perlen aus dem Separator entfernt haben, suspendieren Sie die Perlen in 100 Mikrolitern Assay-Puffer.
Wirbeln Sie 30 Sekunden lang, bevor Sie das Rohr für 60 Sekunden in einen Magnetabscheider legen, um die Perlen zu trennen. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal. Als nächstes passen Sie die Konzentration der Drei-Plex-Arbeitsmikrosphärenmischung an, indem Sie ein geeignetes Volumen Assay-Puffer hinzufügen, um eine Endkonzentration von 100 Mikrosphären pro Mikroliter für jedes Ziel zu erzeugen.
Aliquot 25 Mikroliter der Mikrosphärenmischung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Verdünnen Sie Plasma- oder Serumproben 500-fach im Assay-Puffer und bereiten Sie Standardproben entsprechend der gewünschten Titration vor. Fügen Sie 25 Mikroliter Assay-Puffer als leere Probe hinzu und fügen Sie jede der verdünnten Proben oder den Standard in jede vorgesehene Vertiefung einer 96-Well-Probenplatte hinzu.
Wenn Sie fertig sind, bedecken Sie die Platte mit einer Aluminiumdichtung oder -folie, um eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem auf 700 Umdrehungen pro Minute eingestellten Plattenschüttler zu inkubieren. Bereiten Sie eine Lösung von Antikörpern gegen den menschlichen Nachweis oder sekundären Antikörperlösungen mit vier Mikrogramm pro Mikroliter mit Assay-Puffer vor, wie im Manuskript beschrieben. Legen Sie die Platte auf einen Magnetabscheider, um sie schnell zu waschen, und drehen Sie die Platte dann gewaltsam über einen Biohazard-Behälter, um Flüssigkeit aus den Vertiefungen zu entfernen.
Wenn die Platte noch umgedreht ist, klopfen Sie die Platte kräftig gegen einen dicken Papierstreifen. Waschen Sie dann jede Vertiefung mit 100 Mikrolitern Assay-Puffer und entfernen Sie die Flüssigkeit durch gewaltsame Inversion über einen Biohazard-Behälter. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal.
Nach der letzten Wäsche werfen Sie alle verbrauchten Papierbündel in einen Biohazard-Behälter. Als nächstes fügen Sie 25 Mikroliter sekundäre Antikörper-Arbeitslösung zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu und bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie, um auf einem Plattenschüttler mit 700 Umdrehungen pro Minute zu inkubieren. Nach 30 Minuten Inkubation waschen Sie die Vertiefungen der Platte zweimal mit Assay-Puffer, wie zuvor gezeigt.
Dann fügen Sie 100 Mikroliter Assay-Puffer in jede Vertiefung der 96-Well-Platte hinzu. Decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie fünf Minuten lang auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur. Analysieren Sie eine 60-Mikroliter-Probe über den Geräteanalysator gemäß dem Systemhandbuch.
Zur Optimierung der Inkubationszeit des Probeneinfangs inkubieren Sie die Platten für eine Dauer von 30, 60 und 120 Minuten. Analysieren Sie nach der Inkubation 60 Mikroliter der Assay-Mischung auf dem Analysator. Eine Sieben-Punkt-Standardkurve, die auf einer seriellen Verdünnungsreihe von 1:5 basiert, wurde für den Spike S1, die Membranantikörper und das Nukleokapsid ausgewertet.
Der Intra-Assay-Präzisionstest wurde auf der Platte durchgeführt, um die Assay-Präzision zu bewerten, die als prozentualer Variationskoeffizient, Standardabweichung und Durchschnitt berechnet wurde. Für die Präzision zwischen den Assays wurden für jeden Assay drei verschiedene Chargen der Perlensets vorbereitet. Es wurden Präzisionsvariablen des Assays mit den Standard- und den humanen Plasmaproben berechnet.
Die durchschnittlichen medianen Fluoreszenzintensitätswerte bei 120 Minuten der Inkubation waren optimal für IgG-Titer für die Spike-S1-, die Membran- und die Nukleokapsid-Antikörper, was auf eine schnelle primäre Antikörperbindungskinetik hinweist. Sekundäre Antikörperkonzentrationsoptimierungen in Zweikanalleistung zeigten eine breite Palette von Signalen in linearer Messung für alle Konzentrationen. Die beobachteten Signale aus verschiedenen Zeitinkubationen der Sekundärantikörper und die Details zu den Signalveränderungen für alle Inkubationszeiten sind hier dargestellt.
Bei den Spezifitätsbewertungen für Zweikanal-Assays wurde eine vernachlässigbare Kreuzsignalkontamination zwischen dem Blank- und dem Single-Reporter-Kanal beobachtet. In der Darstellung von Sero-Konversionsereignissen nach der COVID-19-Impfung waren die beobachteten Spike-S1-IgA- und IgM-Werte etwa 40-mal niedriger als die IgG-Isotyptiter. Diese Methode hat wichtige Auswirkungen auf die Überwachung der Reaktion auf Impfstoffe bei immungeschwächten Personen.
Es wird uns erlauben festzustellen, ob diese Patienten wirklich durch diese Impfungen geschützt werden.
