Dieses Protokoll bietet eine einfache Methode der fixativen Perfusion bei Mäusen, die die histologische Untersuchung von ZNS-Geweben ohne nennenswerte Investitionen ermöglicht. Der Hauptvorteil der hier vorgestellten Schwerkraftperfusionsmethode besteht darin, dass die Füllkörperapparatur mit leicht verfügbaren Komponenten konstruiert werden kann. Das Verfahren wird Arnav Rana, ein MD-Doktorand aus dem Labor von Dr. Xin Jie Chen, demonstrieren.
Um zu beginnen, schneiden Sie mit einer scharfen Rasierklinge die inneren Strohhalme aus zwei 500-Milliliter-Waschflaschen, indem Sie sie bündig auf die Innenseite der Schraube am Verschluss schneiden. Schneiden Sie ein vier mal vier Zentimeter großes quadratisches Loch in den Boden jeder Pufferflasche und schneiden Sie dann ein weiteres kleines Loch in den Boden jeder Flasche, um den Durchgang eines gebogenen Edelstahl-Mikrospatels zu ermöglichen. Als nächstes erstellen Sie eine S-förmige Biegung in den Mikrospateln, so dass sie als Haken zum Aufhängen der Pufferflaschen verwendet werden können.
Setzen Sie die gebogenen Mikrospatel in die entsprechenden Öffnungen in den Pufferflaschen ein. Als nächstes verbinden Sie zwei 25 Zentimeter lange Rohre fest mit den äußeren Flaschenstrohauslässen und verbinden die Enden dieser Rohre mit dem Y-Stecker, dann verbinden Sie den 2 Meter langen Schlauch mit dem freien Ende des Y-Steckers. Nachdem Sie den Kolben von einer 1-Milliliter-Spritze entfernt haben, schneiden Sie die Spritze etwa 6 Zentimeter von der Spitze entfernt, indem Sie zuerst den Kunststoff mit einer Rasierklinge ritzen und dann den Spritzenkunststoff scharf schnappen.
Führen Sie die Schnittfläche der Spritze bis zu einer ausreichenden Tiefe in das freie Ende des Kunststoffschlauches ein und sorgen Sie für eine dichte Abdichtung. Als nächstes kennzeichnen Sie eine Pufferflasche als PFA und die andere als PBS. Messen Sie etwa 1/3 der Länge weg von der Flaschenöffnung und ziehen Sie an dieser Stelle eine Linie um den Flaschenumfang, um den entsprechenden Füllstand der perfusatierten Lösungen anzuzeigen.
Nachdem Sie eine große Büroklammer begradigt haben, erstellen Sie eine Schlaufe, die um den Umfang des Schlauches passt, und legen Sie diese Schlaufe um den Schlauch, nur proximal zur Spritze, dann legen Sie einen Styroporblock in die Glasschale, legen Sie die Enden der Büroklammer in den Styroporblock, um den Schlauch zu befestigen und mit einem Papiertuch, Heben Sie das vordere Ende der Glasschale um etwa 2 Zentimeter an. Nachdem Sie ein 1-Liter-Becherglas mit destilliertem Wasser gespült haben, füllen Sie es mit etwa 800 Millilitern 18 Milliohm molekularbiologischem Wasser. Erhitzen Sie das Becherglas in einer Mikrowelle für drei Minuten oder bis die Wassertemperatur 65 Grad Celsius erreicht, und legen Sie es dann auf eine Heizungs- oder Rührplatte, die in einem Abzug aufbewahrt wird.
Als nächstes spülen Sie eine Rührstange mit destilliertem Wasser aus und legen Sie sie in das Becherglas. Starten Sie den Rührer und drehen Sie die Kochplatte auf mittlere Hitze, um sicherzustellen, dass die Wassertemperatur nicht über 70 Grad Celsius steigt. Nachdem Sie eine chirurgische Maske, Handschuhe und einen Laborkittel getragen haben, messen Sie 40 Gramm PFA-Pulver und fügen Sie es in das erhitzte Wasser hinzu, dann fügen Sie mit einer Transferpipette ein paar Tropfen 5-Mol-Natriumhydroxid zur Lösung hinzu.
Lassen Sie das Pulver vollständig auflösen. Wenn sich das Pulver noch nicht vollständig aufgelöst hat, fügen Sie bei Bedarf mehr Natriumhydroxid hinzu. Sobald sich das gesamte PFA fast aufgelöst hat, stoppen Sie das Rühren und Erhitzen und fügen Sie sofort 100 Milliliter 10x PBS hinzu, dann verwenden Sie das 18 Milliohm molekularbiologische Wasser, um das Becherglas auf die 1-Liter-Marke aufzufüllen.
Decken Sie das Becherglas mit Plastikfolie ab und legen Sie es in einen Gefrierschrank von minus 20 Grad Celsius, bis die Lösung Raumtemperatur erreicht. Nachdem Sie ein pH-Messgerät mit geeigneten Standards kalibriert haben, messen Sie den pH-Wert der Lösung, während sich das Becherglas auf einer Rührplatte befindet. Salzsäure zugeben, bis der pH-Wert 7,4 erreicht.
Wenn der pH-Wert zu niedrig ist, fügen Sie 5-Mol-Natriumhydroxid hinzu, um den pH-Wert zu erhöhen. Als nächstes schließen Sie einen Isolierkolben an das Vakuum an und legen Sie einen sauberen Buchner-Keramiktrichter mit Filterpapier in den Kolben. Nachdem Sie das Vakuum eingeschaltet haben, befeuchten Sie das Filterpapier mit einer Transferpipette, die mit der 4% PFA-Lösung gefüllt ist, und gießen Sie die Lösung dann langsam auf das Filterpapier, bis die gesamte Lösung gefiltert ist.
Nach dem Filtern die Lösung bis zur Verwendung in einem lichtgeschützten Behälter bei 4 Grad Celsius lagern. Legen Sie im Abzug einen Styropor-Sezierblock in eine Glasschale. Stellen Sie sicher, dass der Sezierblock fünf bis sechs kurze Nadeln hat, um die Maus während der Operation zurückzuhalten, und zwei lange Nadeln, um den Perfusionsschlauch zu unterstützen.
Als nächstes spülen Sie die Perfusionsapparatur mit destilliertem Wasser ab. Nachdem das Wasser abgelassen ist, hängen Sie die Flaschen im Überfluss einen Meter über das zu durchblutende Tier auf und bereiten Sie dann unsteriles 1x PBS mit 10x PBS vor, das mit molekularbiologischem Wasser verdünnt ist. Klemmen Sie die Hauptleitung der Perfusionsvorrichtung mit einem Hämostat und klemmen Sie dann die PFA-Leitung mit einem anderen Hämostaten ein.
Nachdem Sie den Pufferbehälter mit PBS gefüllt haben, legen Sie das Spritzenende der Perfusionsvorrichtung in ein Becherglas, um Abfallpuffer zu sammeln und den Hämostat zu entfernen, der die Hauptleitung verdeckt. Während das PBS durch die Leitung fließt, klopfen Sie kräftig auf die Wände des Rohrs, um eingeschlossene Luft zu entfernen. Sobald die gesamte Luft aus dem Puffer und den Hauptleitungen entfernt wurde, schließen Sie die Strömung ab, indem Sie einen Hämostat auf die Hauptleitung legen.
Als nächstes entfernen Sie den Hämostat aus der PFA-Linie, so dass der PBS rückläufig bis zur PFA-Flasche fließen kann, während er alle Blasen in der PFA-Linie abstößt. Lassen Sie das PBS weiterhin in die PFA-Linie, bis es direkt über der Öffnung der Flasche zu sehen ist, und schließen Sie dann die PFA-Linie mit einem Hämostat ab, um den Fluss von PBS in die PFA-Flasche zu stoppen. Als nächstes verbinden Sie die Schmetterlingsinfusionsnadel mit der Perfusionsspritze und öffnen Sie den Hauptleitungshämostat, um PBS durch die Leitung zu spülen und Blasen aus der Perfusionsspritze zu entfernen.
Nachdem die Blasen entfernt wurden, schließen Sie den Hämostat der Hauptleitung. Stellen Sie sicher, dass die PBS-Flasche jetzt ungefähr 1/3 voll PBS ist. Falls erforderlich, spülen Sie PBS durch die Hauptleitung oder füllen Sie mehr PBS in die Pufferflasche, bis 1/3 ihrer vollen Kapazität erreicht ist.
Sobald alle Blasen aus den PBS-, PFA- und Hauptlinien entfernt wurden, füllen Sie die PFA-Flasche mit 4% PFA-Lösung bei Raumtemperatur bis zur schwarzen Markierung auf der Flasche. Als nächstes bereiten Sie sich auf eine Nicht-Überlebensoperation vor, indem Sie die notwendigen Instrumente zuerst mit Wasser und dann mit 70% Ethanol reinigen. Nachdem Sie eine betäubte C57 schwarze 6J-Maus am Styroporblock befestigt haben, beginnen Sie die Operation, indem Sie die Bauchhaut mit einer Hautzange anheben und mit einer großen Schere durch die Bauchdecke schneiden.
Setzen Sie den Bauchschnitt überlegen in Richtung Leber fort, lösen Sie dann die Leber von der vorderen Bauchdecke und setzen Sie den anfänglichen Schnitt überlegen in Richtung Zwerchfell fort. Wenn der Schnitt das Zwerchfell erreicht, machen Sie mit einer fein sezierenden Schere ein Loch in die Membran und schneiden Sie durch die Rippen auf der rechten Seite der Maus ungefähr auf halbem Weg zur rechten Achse, dann machen Sie einen ähnlichen, aber längeren Schnitt durch die linke Seite der Membran fast bis zur linken Achse. Reflektieren Sie die Brustwand und befestigen Sie sie am Styroporblock.
Nachdem Sie den linken Ventrikel identifiziert haben, halten Sie mit einer fein gekrümmten Pinzette das Herz mit leichtem Druck stabil und öffnen Sie dann den Hauptlinienhämostat, damit das PBS durch die Nadel fließen und sofort den linken Ventrikel mit der Nadel durchbohren kann. Stellen Sie sicher, dass die Nadel nicht mehr als 0,5 Zentimeter in den Ventrikel eingeführt wird. Als nächstes ruhen Sie den Schmetterlingsschlauch auf einem X aus Styropor mit zwei großen 18-Gauge-Nadeln.
Identifizieren Sie die untere Hohlvene, wenn sie aus der Leber austritt, und durchbluten Sie sie mit einer fein sezierenden Schere. Fahren Sie mit der PBS-Perfusion fort, bis die Flüssigkeit, die aus der unteren Hohlvene fließt, blutfrei ist, dann arbeiten Sie schnell, schließen Sie die PBS-Linie mit einem Hämostat ab und öffnen Sie die PFA-Linie. Lassen Sie die PFA einige Minuten durchbluten, bis sich der Schwanz zu kräuseln beginnt.
Sobald sich der Schwanz zu kräuseln beginnt, beginnen Sie einen 50-Minuten-Timer. Nach 50 Minuten die Hauptlinie mit einem Hämostat verschließen und die Nadel aus dem linken Ventrikel zurückziehen. Als nächstes legen Sie die Maus über Nacht bei 4 Grad Celsius in einen gekennzeichneten Behälter mit PFA-Lösung.
Eine qualitativ hochwertige Durchblutung wird durch das Fehlen von Blut in Leber, Rückenmark und tiefen Strukturen des zentralen Nervensystems angezeigt. Das im Gehirn beobachtete Blut befindet sich zwischen dem Schädel und der Dura mater und ist daher nicht problematisch oder deutet auf eine Durchblutung von schlechter Qualität hin. Der Nachweis von Alpha-Synuclein nach dieser Perfusionsmethode zeigt, dass phosphoryliertes Alpha-Synuclein bei 15,5 Monate alten symptomatischen Mäusen signifikant höher akkumuliert als bei sieben Monate alten asymptomatischen Mäusen, die menschliches A53T-Alpha-Synuclein exprimieren.
Dieses Ergebnis stimmt mit Berichten überein, die eine Anreicherung der Zytopathologie in den vorderen Hörnern des Rückenmarks und des Mittelhirns dieser Mäuse beschreiben. Es ist wichtig, dass beim Zugang zur Brusthöhle keine Bauchorgane durchtrennt werden. Des Weiteren darf die Perfusionsnadel nicht zu tief im linken Ventrikel platziert werden.
