Diese Arbeit wurde durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), der Systembiologie der Signaltransduktion in Cancer (Helmholtz-Allianz Systembiologie) und dem Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) unterstützt.

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des Instituts des DKFZ durchgeführt. Achtung: Um RNase Kontamination der Proben zu verhindern, nehmen grundlegenden Vorsichtsmaßnahmen zur Vermeidung von RNase-Kontamination und bereiten alle Puffer mit DEPC-behandeltem Wasser. 1. Vorbereitung der Saccharose-Gradienten <ol><li> Bereiten 17,5, 25,6, 33,8, 41,9 und 50% Saccharose-Lösungen (siehe Tabelle 1). Vorbereiten Gradienten durch langsame Zugabe von 2 ml 50% Saccharose-Lösung auf den Boden eines Polyallomer-Ultrazentrifugenröhrchen. Einfrieren der Schicht, indem Röhrchen für 20 min bei -80 ° C. </li><li> Fügen Sie die nachfolgenden Schichten bei abnehm Saccharose Prozent mit Gefrierfach Schritte dazwischen, landen auf 17,5% Saccharose. Halten Gradienten auf Eis während der Zugabe von Saccharose Lösungen, um Auftauen der darunterliegenden Schichten zu verhindern. </li><li> Bereiten Saccharosegradienten frisch einen Tag vor Gebrauch und halten bei 4 ° C Alternatively, Gradienten im Voraus vorbereiten, bei -80 ° C und Auftauen bei 4 ° C in der Nacht vor dem Experiment. </li></ol> 2. Gewebepräparation (Spinal Cord und / oder Gehirn) <ol><li> Betäuben Maus durch eine Überdosis von Xylazin und Ketamin in NaCl und transkardial mit 20 ml Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS), enthaltend 200 ug / ml CHX die Ribosomen zu assoziierten Transkripte immobilisiert Perfusion. Überprüfen Sie die Betäubung durch Nicht-Ansprechbarkeit bis Fuß drückt. </li><li> Auszug Gewebe schnell. Öffnen Sie den Schädel von dorsal und extrahieren das Gehirn. Führen Laminektomie der gesamten Brust-und Lendenwirbelsäule und extrahieren das Rückenmark. Verwenden gesamte Gehirn (~ 400 mg) bzw. 4 cm großes Stück des Rückenmarks (~ 90 mg) auf. </li><li> Übertragen Gewebe in eiskaltes Homogenisierung Puffer A (siehe Tabelle 1) (Rückenmark: 1 ml; Gehirn: 4 ml) und Würfel in kleine Stücke mit einem sauberen Skalpell, um erhöhte Aufnahme von Cycloheximid ermöglichen. Perform alle weiteren Schritte auf Eis. </li><li> Inkubation: 15 min und homogenisieren Gewebe mechanisch mit einer Dounce Homogenisator. Sorgfältig kontrollierte Homogenisierung ist notwendig, um sicherzustellen, dass Kerne intakt bleiben. Behandeln Sie alle Proben genau die gleiche Art und Weise, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Hinweis: für Hirngewebe: Stören Gewebe um 5 Schläge mit einem dicht schließenden Stößel. Für Rückenmarksgewebe: brechen um 5 Schläge mit einem locker sitz Stößel, gefolgt von 5 weiteren Schläge mit einem dicht schließenden Stößel. </li><li> Nehmen Aliquots (400 ul für Gehirn-und 200 ul für Rückenmark), Flash-Speicher, einfrieren und bei -80 ° C für die Gesamt-RNA Isolation. </li><li> Kerne und ungestörten Zell-und Gewebefragmente zu entfernen durch Zentrifugation bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C. Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit verhindert den Verlust von Ribosomen. </li><li> Lyse Membranfragmente in die Kerne freie Überstand für 30 min durch Zugabe von NP-40 und Natriumdeoxycholat Detergenzien (jeweils bis zu einer Endkonzentration von 1%). </li></ol><ol><li> Dieser Schritt entfernt Fettkomponenten aus der Probe, die sonst die Signalmaske wird in der Polyribosom Profil. Zuerst Pre-Chill-Ultrazentrifuge Eimern und Rotor bei 4 ° C und bereiten 2 M, 1,1 M und 0,9 M Saccharose-Lösungen (siehe Tabelle 1). </li><li> Mix Lysat mit einem Volumen von 1,22 2 M Saccharose-Lösung und Transfer in einem Polyethylen-Ultrazentrifugenröhrchen. Füllen Sie alle Rohre zu gleichen Volumen von 10 ml mit 1,1 M Saccharose-Lösung, danach überlagern sie vorsichtig mit 0,9 M Saccharose-Lösung. </li><li> Legen Sie die Ultrazentrifuge Rohre in vorgekühlte Ultrazentrifuge Eimern. Zentrifuge für 3 Stunden bei 100.000 × g bei 4 ° C. Während dieses Prozesses werden Ribosomen in der Pellet hinterlegt wohinFettKomponenten schweben und bleiben im Überstand. </li></ol> 4. Sucrose Gradient Fraktionierung <ol><li> Überstand entfernen und Pellet lösen sich in Homogenisierung Puffer B (siehe Tabelle 1 </strong&gt;). Die Extinktion bei 260 nm für jede Probe unter Verwendung eines Nanodrop oder eine äquivalente Vorrichtung und normalisieren beträgt nach dem Absorptionswert zu laden. </li><li> Platzieren Saccharosegradienten (Herstellung wird in einem vorherigen Abschnitt beschrieben) in die vorgekühlte Ultrazentrifugeneimer. Schichtproben sorgfältig oben auf dem Gradienten. Fügen Sie eine leere Saccharose-Gradienten als die technische Kontrolle. </li><li> Einstellen des Gewichts jeder Eimer mit Homogenisierungspuffer. Zentrifuge Proben für 1,5 Stunden bei 285.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Start der Vorbereitung der Isco Fraktionators 30 Minuten vor dem Ende der Zentrifugation. Wenn ein anderes Modell der Fraktionators verwendet wird, folgen Sie dem Protokoll des Herstellers. <ol><li> Stellen Sie die entsprechende Empfindlichkeit (0,2 AUFS für Gehirn-oder 0,05 AUFS für Rückenmark) für die UV-Lampe und schalten Sie es zum Aufwärmen. Montieren Sie die Rohrbohrer, verbinden Sie es über die Rollpumpe zu 60% Saccharose-Lösung durch das Rohr Piercer. </li><li> Testen Sie das Setup durch Pumpen Saccharose (Fluss Rattee: 1 ml / min), insbesondere sicherzustellen, dass es keine Lecks in den Rohrleitungen, die Blasen in der Steigung vorstellen wird. </li><li> Blank Grundabsorption durch manuelles Pumpen Gradientenpuffer in den UV-Detektor und die Korrektur der Grundlinie. </li></ol></li><li> Die Ultrazentrifuge Eimern, die die Saccharose-Gradienten Entfernen Sie vorsichtig mit sedimentierten Proben aus dem Rotor und legen sie auf Eis. Vermeiden Sie Anstoßen von Gradienten zum Verlust der Auflösung zu verhindern. </li><li> Führen Gradienten auf Fraktionators. Führen Sie erste Grundabsorption beurteilen und eine ordnungsgemäße technische Setup leer Steigungen. <ol><li> Befestigen Gradienten der UV-Detektor und durchbohren die Unterseite des Rohres mit dem Rohr Dorn. Starten Sie den Pump von 60% Saccharose, die die Steigung mit sedimentierten Proben nach oben durch den UV-Detektor und in den Tropfenspender verdrängen wird. </li><li> Die Absorption bei 260 nm dokumentiert die Absorptionsprofil für die Probe zu erzeugen, mit Spitzen, die die Sedimentationtion von mRNAs mit ribosomalen Untereinheiten, monosomes und anschließend zunehmende Anzahl von Ribosomen assoziiert. </li></ol></li><li> Die Proben werden in 20 Fraktionen über das Drop-Spender (jeweils 600 ul, in 2-ml-Röhrchen). </li></ol> 5. RNA-Isolierung aus einzelnen Fraktionen <ol><li> Werden 10% SDS bis zu einer Endkonzentration von 1% zu einzelnen Fraktionen und gut mischen, um Proteine ​​zu entfalten und zu dissoziieren Ribosomen. An diesem Punkt können die Proben bei -80 ° C eingefroren werden, Je nach Fragestellung angegangen werden, können Fraktionen nach dem Absorptionsprofil gebündelt. </li><li> Isolieren RNA mit saurem Phenol / Chloroform-Extraktion, die auch entfernt verunreinigenden Spuren von DNA. <ol><li> In einem Volumen von sauren Phenol / Chloroform (auf RT vorgewärmt) zu jeder Probe, Hitze für 10 Minuten bei 65 ° C und Lösedruck unter dem Abzug danach. </li><li> Zentrifuge Proben für 20 min bei 17.000 × g bei RT. Wässrige Phase in ein neues 1,5 ml vorsichtig übertragenRöhre. Seien Sie sich bewusst von der Phaseninversion in dichter Saccharosefraktionen, wo die wässrige Phase kann an der Unterseite nach Zentrifugation sein. </li><li> In einem Volumen Isopropanol, 1/9 Volumen Natriumacetat (pH 5,2) und 1 ul GlycoBlue zu jeder Probe, um die RNA zu fällen. Halten Proben wenigstens 1 Stunde bei -80 ° C. </li><li> Zentrifugieren für 30 min bei 17.000 × g und 4 ° C. GlycoBlue bietet Visualisierung des Pellets. Überstand entfernen, waschen Pellet einmal mit eiskaltem 80% Ethanol und Pellet an der Luft trocknen. Das Pellet in RNase-freies Wasser. </li></ol></li><li> Quantifizieren RNA-Menge von Nanodrop und analysieren die Integrität der RNA von einem Bioanalyzer Chip. RNA, die durch das vorgestellte Protokoll erhalten wird, ist geeignet für alle hochmoderne Hochdurchsatz-Assays mit Microarray-und Sequenzierungs tief. </li></ol>

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	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. 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Kein Interessenkonflikt erklärt.

Obwohl Polyribosom Fraktionierung ist keine neue Technik, bleibt es eine besondere Herausforderung ein. Auf der Grundlage der Input-Material, können erhebliche Optimierung notwendig sein. Dies ist insbesondere der Fall für die in vivo ZNS-Proben, wobei die Menge des Materials ist oft eine Einschränkung und Fettgewebe Komponenten behindern Isolierung übersetzen mRNAs. Die meisten veröffentlichten Fraktionierung Protokolle befassen sich mit Hefe-oder Säugerzelllinien, und es gibt etablierte Protokolle für das Gehirn 12,13,14. Im Gegensatz dazu gibt es kaum Publikationen, die Fraktionierung von Rückenmark und frühere Protokolle erfordern Rückenmark von einer großen Anzahl von Tieren zu 15 zusammengefasst werden. Aus diesen Gründen wurden einige wesentliche Änderungen vorgenommen, um die Fraktionierung Protokoll für ZNS-Geweben, einschließlich Einzelrückenmark der Maus anzupassen. Ribosom Immobilisierung mit Cycloheximid ist bei Tier Perfusion durchgeführt, um die Dissoziation der Ribosomen Durin vermeideng der lange Prozess der Gewebeentnahme. Anschließend werden polysomaler RNAs in einer bestimmten Art und Weise extrahiert, um Polyribosom Ausbeute zu maximieren. Zuerst kontrolliert die Homogenisierung des Gewebes durch Douncing, hält den Kern intakt und verhindert DNA-Kontamination. Der Kern wird dann zuverlässig durch Zentrifugation entfernt. Die Kombination der Wasch-NP-40 und Natriumdeoxycholat sorgt Lyse des endoplasmatischen Retikulums und Freisetzung der Membran assoziiert Ribosomen. Darüber hinaus UV-absorbierende Komponenten innerhalb der lipidreichen Myelin verschleiern die Polyribosom Profilen. Myelin Flotation ist daher notwendig, wo dichte Verbindungen wie Polyribosomen werden pelletiert und leichter Verbindungen wie Myelin Schwimmer und 16 werden entfernt. Polyribosome werden dann über eine 17,5% bis 50% Saccharose-Gradienten sedimentiert. Anstelle der manuellen Schichtung und Gefrier jedes Saccharose Schicht können auch Steigungen mit einem Gradienten-Mischer hergestellt werden. Extraktion von RNA aus den Fraktionen mit saurem Phenol / Chloroform ermöglicht DNA mit minimalem Verlust RNA entfernt werden. Allerdings kann die Phaseninversion bei dichten Saccharose-Fraktionen (oben Fraktion 16) auftreten. Dieses Protokoll bietet Vorteile gegenüber anderen herkömmlichen Verfahren, die die Ebene der Translation zu adressieren. Beispielsweise sind sowohl die Messung der S6 phosphoryliert (ein prominenter Übersetzung Marker) sowie Kennzeichnung von naszierenden Ketten mit Radioisotopen geben Informationen über globale Übersetzung Ebenen, sondern offenbaren wenig auf, was speziell die übersetzt wird. Polyribosom Fraktionierung, andererseits, ermöglicht nicht nur Beurteilung globaler Übersetzung, sondern auch die Identität der Übersetzung mRNAs und die damit verbundenen regulatorischen Proteinen. Quantitative real-time PCR kann auf isolierte RNA für eine schnelle Auslesen der ausgewählten mRNAs durchgeführt werden und Microarrays und RNA-Sequenzierung der nächsten Generation für genomweite Studien durchgeführt werden. Die hier vorgestellten Optimierungen erlauben die Technik, um mit minimalen Mengen von ZNS-Gewebe verwendet werden, daher verringernten die Zahl der Tiere erforderlich ist und die Verbesserung der allgemeinen experimentellen Qualität durch Verringerung Gewebeverarbeitungszeit. Auf der anderen Seite kann diese Technik nicht unterscheiden gekippt Ribosomen übersetzen diejenigen. Transcripts Durchführung installiert Ribosomen werden in den schweren Fraktionen sedimentieren, und dies sollte bei der Interpretation der Daten aufbewahrt werden. Es gibt neuere Techniken gemeldet, nämlich RiboTaq und TRAP, in denen Ribosomen sind mit Epitop-Tags oder Reportern, die jeweils in einer Zelltyp-spezifische Weise markiert und die zugehörigen mRNAs durch Immunpräzipitation 17,18 isoliert. Diese Technik kann auf die Fraktionierung Polyribosom hohe Auflösung für spezifische Zellpopulationen zu lesen bieten gekoppelt werden. Ribosom Fuß-Druck ist eine weitere neuartige Technik, Nucleaseverdau geht um kleine Fragmente zu erzeugen, oder &quot;Footprints&quot;, von mRNAs, die von Ribosomen geschützt sind. Bibliotheken werden dann aus diesen Spuren erzeugt und sequenziert. Diese Methode provIdes ein Codon-spezifische Analyse des gesamten Genoms auf Übersetzung und in der Lage ist ins Stocken geraten Ribosomen zu identifizieren, nicht-AUG-Codons und kleinen vorgelagerten offenen Leserahmen, die nicht durch Fraktionierung Polyribosom 19 erreicht werden kann. Allerdings kann Polyribosom Fraktionierung Ribosom Profiling für die Isolierung von verdauten Fragmente mit einzelnen Ribosomen gekoppelt werden, und bereichert damit für die molekulare Spezies für Bibliotheks Vorbereitung, in denen hohe Reinheit der Probe ist oft erforderlich, benötigt wird. Zusammengenommen ist Polyribosom Fraktionierung eine flexible Methode mit bleibender Bedeutung und kann zu verschiedenen Downstream-Anwendungen einschließlich der genomweiten Untersuchungen wie Next-Generation-Sequenzierung gekoppelt werden.

Genexpression wird durch die kombinierte Wirkung der Transkription, Translation und Stabilität von mRNA und Proteinen bestimmt, wobei die Translationslager vorherrschende Wirkung 1. Es ist nun klar, daß jeder dieser Schritte ist stark reguliert. Mikro-RNAs, die Bildung von RNA-Granulat, alternative und zytoplasmatische Polyadenylierung sind einige Beispiele der posttranskriptionelle Regulation der Genexpression 2,3. Jeder dieser Mechanismen entkoppelt Transkription von Übersetzung und beeinflusst das Proteom im biologischen System von Interesse. So überraschend, mRNA-Spiegel allein sind eine unvollkommene Auslesen der Protein-Ebene 4. Quantitative Proteomik bietet die direkte Beurteilung der Genexpression, aber trotz der jüngsten Fortschritte gibt es immer noch erhebliche Einschränkungen auf Empfindlichkeit und Auflösung Sequenz Protein. Daher Bewältigung der translatome, das Repertoire der Übersetzung mRNAs, bietet einen hervorragenden Kompromiss zwischen Studium derTranskriptom-und Proteom. Es ist genauer als bei der Beurteilung der letzten Transkriptomik Genexpression und bietet sowohl höhere Abdeckung und Reihenfolge Auflösung als Proteomik. In Säugersystemen, die Mehrheit der Übersetzung Veranstaltungen beginnen über cap-abhängigen Initiation. Eine Gruppe von eukaryotischen Initiationsfaktoren zusammen mit der kleinen 40S ribosomalen Untereinheit zusammen am 5&#39;-Kappe einer mRNA. Der Komplex dann scannt die mRNA und bei Erreichen der Start-Codon AUG, wirbt die 60S großen ribosomalen Untereinheit zu bilden, eine komplette 80S-Ribosomen. Die Dehnungsstufe fährt mit dem Ribosom sich entlang der mRNA, mit Elongationsfaktoren Unterstützung der Aufnahme von Aminosäuren aus geladenen tRNAs für die entstehende Peptidkette. Mehreren Ribosomen entlang einer einzigen mRNA gleichzeitig erfolgen und die Anzahl der zugehörigen Ribosomen wurde gezeigt, dass die Rate der Proteinsynthese 5,6 korrelieren. Dies macht ribosomalen Lade eine zuverlässige Indikation für translation und ermöglicht die Trennung von aktiv übersetzen mRNAs auf Basis Senkungsgeschwindigkeit. Neben der Quantifizierung der Übersetzung von mRNAs kann Sequenzinformationen erhalten werden, um Motive in der Translationsregulation beteiligt sind. Auch RNA-bindende Proteine ​​und andere Faktoren können Übersetzung aus verschiedenen Fraktionen isoliert werden, erleichtern das Studium und die Entdeckung der damit verbundenen regulatorischen Proteinen. Im Nervensystem hat Translationskontroll Prozessen wie mRNA, Lagerung, Transport und lokale Proteinsynthese verbunden. Wachstumskegeln haben gezeigt, dass eine bestimmte lokale Pool von mRNAs vom Rest des Axons 7 beherbergen. Außerdem Axone besitzen die Fähigkeit, lokal Proteine ​​synthetisieren 8,9. Als Ergebnis lokale Steuerung der Übersetzung ist zu einem entscheidenden Thema der Studie in der Neurobiologie. Das Potential der Polyribosom Fraktionierung, um diese Adresse in mehreren Studien veranschaulicht worden, bei dem die Technik wurde verwendetuntersuchen Axon Führung in Rückenmark-Entwicklung, und zeigte die aktivitätsabhängige Übersetzung von BDNF im Gehirn 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

Mehrere Verfahren sind in der Genexpression einschließlich Transkription, Translation und Stabilität von mRNAs und Proteine ​​beteiligt. Jeder dieser Schritte sind fest geregelt und betrifft die letzten Dynamik von Proteinfluss. Verschiedene Regulationsmechanismen sind im Übersetzungsschritt, wodurch mRNA-Konzentrationen allein ein unzuverlässiger Indikator der Genexpression. Darüber hinaus werden lokale Regulation der mRNA-Übersetzung wurde insbesondere in neuronalen Funktionen beteiligt, Verlagerung &#39;translatomics&#39;, um den Fokus der Aufmerksamkeit in der Neurobiologie. Die vorgestellte Methode kann auf Brücke Transkriptomik und Proteomik eingesetzt werden. Hier beschreiben wir wesentliche Änderungen an der Technik der Polyribosom Fraktionierung, die die translatome fragt auf der Grundlage der Vereinigung von aktiv übersetzt mRNAs mehrere Ribosomen und ihre differentielle Sedimentation in Saccharose-Gradienten. Traditionell, die Arbeit mit in-vivo-Proben, insbesondere des central Nervensystem (ZNS) ist schwierig, da es die begrenzten Mengen an Material und die Anwesenheit von Fettgewebe Komponenten bewährt. Um dieses Problem anzugehen, ist die beschriebene Protokoll für die Verwendung mit minimalem ZNS-Material optimiert ist, wie durch die Verwendung von einzelnen Mausrückenmark und Gehirn nachgewiesen. Kurz gesagt, werden ZNS-Gewebe extrahiert und übersetzen Ribosomen auf mRNAs mit Cycloheximid immobilisiert. Myelin Flotation wird dann durchgeführt, um lipidreichen Komponenten zu entfernen. Fraktionierung auf einem Saccharose-Gradienten in dem mRNAs werden nach ihrer ribosomalen Lade getrennt durchgeführt. Isolierten Fraktionen eignen sich für eine Reihe von Tests abwärts, einschließlich der neuen genomweiten Testtechnologien.

Abbildung 2 zeigt repräsentative Polyribosom Profile nach der Fraktionierung. Die Profile von Gehirn und Rückenmark charakteristische Absorptionskurven wie zuvor für Zelllinien beschrieben. mRNAs zu kleinen ribosomalen Untereinheiten (40S) Sediment am leichteren Fraktionen gebunden und erscheinen zunächst als ein Gipfel auf dem Profil, gefolgt von der großen ribosomalen Untereinheit (60S) und monosome (80S) gebunden mRNAs. mRNAs für mehrere Ribosomen gebunden sedimentieren schwereren Fraktionen, die später mit Peaks, die zunehmende Anzahl von gebundenen Ribosomen. Globale Übersetzung kann aus dem Profil beurteilt werden. Als Beispiel hat Hirngewebe eine höhere Polyribosom Verhältnis monosome als Rückenmarksgewebe, was aktiver Übersetzung. RNA aus einzelnen Fraktionen extrahiert wurden von Bioanalyzer beurteilt, welche die Verteilung der 18S-28S rRNA und. 18S rRNA früher erscheint in dem Profil in Übereinstimmung mit der kleinen ribosomalen Untereinheiten Sedimentieren in leichter sucr<html> ose Fraktionen. Typische Ausbeuten von Gesamt-RNA sind 10-20 ug für Gehirn-und 4.2 ug für Rückenmark. RNA-Ausbeuten aus den einzelnen Fraktionen bis zu 4 &amp;mgr; g und 0,8 &amp;mgr; g für Gehirn und Rückenmark sind, abhängig von der Fraktion. Eine leere Saccharose-Gradienten zeigt bereits einige Hintergrundabsorption bei 260 nm, durch die Anwesenheit von DTT. Dieser Hintergrund kann bei der Datenanalyse, um Probenwerte normalisieren abgezogen werden. EDTA-Behandlung brach die Polyribosom Gipfel, zeigt die Sedimentation Profil ist auf Übersetzung. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Workflow-und Anwendungsmöglichkeiten in vivo Polyribosom Fraktionierung.&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Abbildung 2. (A) Typische Polyribosom Profile von Gehirn und Rückenmark, mit der Beurteilung der extrahierten RNA durch Bioanalyzer. (B) Verteilung von mRNA über Gapdh Fraktionen durch qRT-PCR. (C) Polyribosom Profile von leeren Farbverlauf und das Gehirn mit und ohne EDTA-Behandlung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> 2x Gradientenpuffer </td><td> 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 30 mM MgCl 2, 600 mM NaCl, 200 &amp;mgr; g / ml Cycloheximid (CHX), 2 mM Dithiothreitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> Saccharose-Lösung 17,5% </td><td> 8,67 g Saccharose, 25 ml 2x Gradienten Puffer auf 50 ml DEPC-H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> Saccharose-Lösung 25,6% </td><td> 12,8 g Saccharose, 25 ml 2x Gradienten Puffer auf 50 ml DEPC-H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> Saccharose-Lösung 33,8% </td><td> 16,9 g Saccharose, 25 ml 2x Gradienten Puffer auf 50 ml DEPC-H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> Saccharose-Lösung 41,9% </td><td> 20,95 g Saccharose, 25 ml 2x Gradienten Puffer auf 50 ml DEPC-H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> Saccharose-Lösung 50% </td><td> 25 g Saccharose, 25 ml 2x Gradienten Puffer auf 50 ml DEPC-H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> HomogenisierungPuffer A </td><td> 0,25 M Saccharose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4), 5 mM MgCl 2, 25 mM KCl </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche komplette Proteaseinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 100 U / ml RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 2M Saccharose-Lösung </td><td> 68,4% Saccharose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl 2, 25 mM KCl </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche komplette Proteaseinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1,1 M Saccharose-Lösung </td><td> 38,5% Saccharose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl 2, 25 mM KCl </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche komplette Proteaseinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0,9 M Saccharose-Lösung </td><td> 30,8% Saccharose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl 2, 25 mM KCl </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche komplette Proteaseinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization Puffer B </td><td> 0,25 M Saccharose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl 2, 25 mM KCl, 1% NP-40, 1% Natriumdesoxycholat </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche komplette Proteaseinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 100 U / ml RNAsin </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Liste von Puffern und Lösungen.

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In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Dieses Protokoll stellt wesentliche Änderungen Polyribosom Fraktionierung, um die translatome von in vivo ZNS-Proben zu untersuchen. Es ermöglicht umfassende Beurteilung der Übersetzung und der Transkriptionsregulation durch die Isolierung und der Vergleich der Gesamt-RNA gebunden Ribosomen-RNA-Fraktionen.

In-vivo-Abfrage des Zentralen Nervensystems durch Translatome Polyribosom Fraktionierung

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

in-vivo-interrogation-central-nervous-system-translatome-polyribosome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

12.2K Aufrufe.  German Cancer Research Center (DKFZ).  Dieses Protokoll stellt wesentliche Änderungen Polyribosom Fraktionierung, um die translatome von in vivo ZNS-Proben zu untersuchen. Es ermöglicht umfassende Beurteilung der Übersetzung und der Transkriptionsregulation durch die Isolierung und der Vergleich der Gesamt-RNA gebunden Ribosomen-RNA-Fraktionen. 

Serie: In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Optic Nerve Durchtrennung: Ein Modell des Adult Neuron Apoptose in das zentrale Nervensystem

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Eine Verletzung Paradigm Central Nervous System Repair in Untersuchen<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Funktionale Bewertung der biologischen Neurotoxine in Networked Cultures für Stammzell abgeleitete Zentralnervensystem Neuronen

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...