Dieses Protokoll ermöglicht die Entdeckung neuartiger Nematizide zur Bekämpfung von Ditylenchus dipsaci durch Kultivierung von Techniken und chemischen Siebensystemen mit mittlerem Durchsatz. Die Einfachheit dieser Technik ermöglicht das Screening von Tausenden von Verbindungen pro Woche, um Verbindungen mit nematizidem Potenzial zu identifizieren. Diese Technik kann neue Verbindungen identifizieren, um pflanzenparasitäre Nematoden von Nutzpflanzen abzutöten und somit die globale Nahrungsmittelversorgung zu erhöhen.
Bereiten Sie zunächst 500 Milliliter Nähr-Agar oder NA-Medien mit 23 Gramm pro Liter NA und Reinstwasser vor. Gießen Sie in steriler Technik 25 Milliliter autoklavierte NA-Medien in 20 Einweg-Petrischalen mit einem Durchmesser von 100 Millimetern und einer Tiefe von 15 Millimetern. Bereiten Sie 500 Milliliter Gamborg B5 oder GA-Medien vor, die 3,2 Gramm pro Liter GA-Basalmedium mit minimalen organischen Stoffen, 20 Gramm pro Liter Saccharose, 15 Gramm pro Liter Agar und destilliertes Wasser enthalten.
Gießen Sie in steriler Technik 50 Milliliter autoklavierte GA-Medien in 10 Einweg-Petrischale. Um eine Saatgutsterilisation durchzuführen, gießen Sie 150 Erbsensamen in ein steriles Zwei-Liter-Becherglas mit einem Rührstab in der Nähe einer Bunsenbrennerflamme auf einem Labortisch. Geben Sie 200 Milliliter 95% Ethanol in die Samen und rühren Sie fünf Minuten lang kräftig auf der Rührplatte um.
Gießen Sie dann Ethanol in einen Abfallbehälter. Gießen Sie Bleichlösung in das Becherglas, um die Samen vollständig einzutauchen. Auf einer Rührplatte 20 Minuten lang kräftig umrühren.
Dann gießen Sie das Bleichmittel in einen Abfallbehälter. Gießen Sie destilliertes Wasser in das Becherglas, um die Samen einzutauchen und 20 Minuten lang kräftig auf einer Rührplatte zu rühren. Nach der letzten Wasserwäsche sterilisierte Samen in die Glas-Petrischale gießen.
Um auf Verunreinigungen zu prüfen, übertragen Sie sechs Samen mit sterilisierten Pinzetten auf jede 10 Zentimeter große NA-Platte in der Laminar-Flow-Haube. Ordnen Sie die Samen um den Umfang des Tellers an. Wickeln Sie die Platten einzeln in Laborfolie ein und inkubieren Sie sie im Dunkeln drei Tage lang bei 26 Grad Celsius.
In einer Laminar-Flow-Haube zwei nicht kontaminierte Samen auf jeder GA-Platte mit sterilisierter Pinzette beschichten. Bei Raumtemperatur für 7 bis 10 Tage inkubieren, damit die Samen sprießen können. Bereiten Sie 50 Milliliter 20-Gramm-pro-Liter-Saccharoselösung vor.
Die Saccharoselösung filtrieren und beiseite stellen. Schneiden Sie in einer laminaren Durchflusshaube ein Stück Agar, das Wurzelgewebe enthält, aus einer vorhandenen Kulturplatte. Pipette 500 Mikroliter Saccharoselösung auf neue GA-Platte mit Erbsensämlingen und legen Sie einen Agarwürfel auf die Saccharose.
Pflegen Sie die Kultur in einer mit Aluminiumfolie ausgekleideten Box bei Raumtemperatur. Um die Kultur zu erhalten, subkulturieren Sie die Nematoden alle acht bis neun Wochen auf frischen GA-Tellern. Nematoden sind nach etwa acht Wochen bereit, extrahiert zu werden.
Schneiden Sie in einer Laminar-Flow-Haube das Agar- und Wurzelgewebe mit einem sterilen Skalpell in einen Zentimeter große Würfel. Geben Sie die Agarwürfel in den mit Kaffeefiltern ausgekleideten Trichter und gießen Sie langsam destilliertes Wasser auf das Agar, um den Kaffeefilter zu befeuchten. Entfernen Sie den mit Kaffeefiltern ausgekleideten Trichter aus dem Becherglas und füllen Sie das Becherglas mit destilliertem Wasser, bis der Wasserstand gerade den Boden des Filters berührt, sobald der mit Kaffeefiltern ausgekleidete Trichter ersetzt ist.
Decken Sie den mit Kaffeefiltern ausgekleideten Trichter und das Becherglas mit Aluminiumfolie ab. Um die Würmer zu sammeln, entfernen Sie den mit Kaffeefiltern ausgekleideten Trichter und saugen Sie die oberen 40 Milliliter Wasser aus dem Auffangbecher ab, ohne die abgesetzten Würmer zu stören. Sammeln Sie die restliche Flüssigkeit in einem 15-Milliliter-konischen Zentrifugenröhrchen mit einer serologischen 10-Milliliter-Kunststoffpipette.
Um die Assay-Platten vorzubereiten, gießen Sie autoklavisch destilliertes Wasser in einen sterilen Trog und geben Sie 40 Mikroliter destilliertes Wasser aus dem Trog in jede Vertiefung einer flachen 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette. Fügen Sie Chemikalien aus den 96-Well-Chemiematerialplatten zu den Assay-Platten hinzu, indem Sie dreimal in die Chemikalienplatte einstecken. Übertragen Sie dann die Pins 10 Mal in die Assay-Platte.
Vor der Reinigungslösung auf Papier tupfen. Um die Anzahl der Nematoden aus der Sammlung zu zählen, setzen Sie zuerst die Sammlung wieder auf und pipettieren Sie dann fünf Mikroliter der Lösung mit Spitzen mit geringer Retention auf einen Objektträger. Zählen Sie die Anzahl der Nematoden in fünf Mikrolitern mit einem Dissektionsmikroskop.
Stellen Sie dann die Konzentration mit sterilem, destilliertem Wasser auf zwei Würmer pro Mikroliter ein. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter der Probe zu jeder Vertiefung der 96-Well-Platten mit einer Mehrkanalpipette und einem Trog hinzu. Wickeln Sie die Teller mit einem feuchten Papiertuch ein und legen Sie sie in eine Schachtel.
Fügen Sie dann ein zusätzliches feuchtes Papiertuch hinzu, um die Platten zu stabilisieren und eine minimale Bewegung der Platten zu gewährleisten, und befestigen Sie es auf einem klebrigen Pad in einem 20-Grad-Celsius-Schüttelinkubator, der auf 200 U / min eingestellt ist. Beobachten Sie die Platten am fünften Tag unter einem Seziermikroskop. Zählen Sie die Anzahl der mobilen und gesamten D.dipsaci in DMSO-Lösungsmittelkontrollen und medikamentenbehandelten Bohrlöchern.
Wenn die Würmer unbeweglich sind, fügen Sie zwei Mikroliter einmolares Natriumhydroxid zu einer Endkonzentration von 40 Millimolar in die Vertiefung hinzu, um die Bewegung zu stimulieren. Berechnen Sie den Anteil mobiler Würmer. In den D.dipsaci-Bildschirmen werden Vertiefungen, die reproduzierbar 0% mobile Würmer ergaben, als starke Treffer kategorisiert.
Drei verschiedene Wirkstoffplatten wurden in einer Konzentration von 60-Mikromolar untersucht, wobei jede Wirkstoffplatte drei biologische Replikate aufweist. Alle drei Platten enthielten 6% der DMSO-Lösemittelkontrollen. Vielen Platten, die Medikamente aus der niedermolekularen Bibliothek enthielten, fehlte jedes Molekül mit beobachtbarer Bioaktivität gegen D.dipsaci.
Einige Platten hatten vollständig reproduzierbare Treffer, während andere, die charakterisierte Nematizide enthielten, in ihrer Aktivität variierten. Die Fehlerindikatoren stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. Hier zeigte Fluopyram eine robuste Aktivität im Assay.
Fluopyram induzierte eine scheinbare dosisabhängige Wirkung auf die D.dipsaci-Mobilität mit einem EC50 von 9,3-Mikromolaren. Oxamyl hatte bis zu einer Konzentration von 120 Mikromolaren keinen signifikanten Einfluss auf die Mobilität. Oxamyl hatte bis zu einer Konzentration von 120 Mikromolaren keinen signifikanten Einfluss auf die Mobilität.
Die Zugabe von Natriumhydroxid verbesserte die Assay-Empfindlichkeit beim Nachweis unbeweglicher Würmer. 40-Millimolar Natriumhydroxid wurden als Assay-Endpunkt verwendet, um die Bewegung bei fähigen Personen zu stimulieren und somit ruhende Würmer von kranken Würmern zu unterscheiden. Dieses Protokoll hat die Identifizierung von Verbindungen mit neuartigen Wirkmechanismen gegen D.dipsaci und andere Spezies ermöglicht.
