Diese Methode kann einen Einblick in die genetische Variation der nicht-photochemischen Abschreckung geben, die in genetischen Diversitätspanels oder Zuchtpopulationen verfügbar ist. Der Hauptvorteil dieser Technik ist das Potenzial, eine große Anzahl von Genotypen innerhalb eines einzigen Tages auf Variationen in der nicht-photochemischen Abschreckung zu untersuchen. Das Protokoll wird für Glycine max oder Sojabohnen vorgestellt, kann aber angepasst werden, um andere Pflanzenräume zu analysieren, aus denen Liftscheiben gesammelt werden können.
Für jemanden, der das Protokoll zum ersten Mal ausführt, ist der Schlüssel die Handhabung der Hebescheibe, um Schäden oder Übersättigung der Schwämme mit Wasser zu vermeiden. Um zu beginnen, beproben Sie die Pflanzen 30 Tage nach der Keimung auf dem Feldplatz. Füllen Sie 1/3 des destillierten Wassers in alle Brunnen einer 24-Well-Platte.
Beschriften Sie den Deckel und die Seite der Platte mit den zu beprobenden Repliken. Halten Sie das jüngste vollexpandierte Blatt an der Oberseite der Pflanze gegen einen Gummistopfen. Drücken Sie einen Humboldt-Korkbohrer Nummer zwei durch das Blatt und drehen Sie, um eine Scheibe zu schneiden, wobei Sie die Mittelrippe vermeiden.
Sammeln Sie nacheinander fünf Discs aus demselben Blatt für technische Replikate. Drücken Sie die Blattscheiben mit einem Wattestäbchen aus dem Korkbohrer in eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Platte und wiederholen Sie dies für eine andere Pflanze desselben Genotyps. Überprüfen Sie, ob alle Blattscheiben im Wasser schwimmen.
Wenn nicht, bewegen Sie Blattscheiben, die an der Seite eines Brunnens haften, vorsichtig in eine schwimmende Position mit einem Wattestäbchen. Fahren Sie mit dem Sampling von Discs aus dem folgenden Diagramm fort. Platzieren Sie den Deckel und versiegeln Sie ihn mit einer halbtransparenten flexiblen Folie.
nach Abschluss der Probenahme in der gesamten 24-Well-Platte. Bewahren Sie die Platte vor direkter Sonneneinstrahlung in einem Beutel, einer Schachtel oder einem leeren Kühler auf. Klopfen Sie in einem sauberen Laborraum auf den Deckel der versiegelten Platte, um Blattscheiben zu entfernen, die während des Transports am Deckel haften.
Wickeln Sie die Folie aus und entfernen Sie den Deckel. Übertragen Sie eine Blattscheibe von der ersten Position der 24-Well-Platte in eine frische 96-Well-Platte, wobei die Blattscheibe flach nach unten am Boden des Bohrlochs zeigt. Schneiden Sie einen Nasensaugerfilter in zwei Hälften.
Tauchen Sie den resultierenden Filter halb in Wasser und tupfen Sie auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Setzen Sie den Filter mit der Blattscheibe in den Brunnen ein, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Nehmen Sie eine zweite Blattscheibe von der ersten Position der 24-Well-Platte und legen Sie sie mit der Vorderseite nach unten in die nächste verfügbare Position der 96-Well-Platte.
Tauchen Sie die restliche Hälfte des in Wasser produzierten Nasenfilters und tupfen Sie ihn auf ein Papiertuch, bevor Sie ihn mit der zweiten Blattscheibe in den Brunnen einführen. Kleben Sie die obere rechte Ecke ab, um die Platte im Dunkeln für die Bildgebung auszurichten. Dichten Sie Platten mit einer halbtransparenten flexiblen Folie ab und wickeln Sie die Platte in Aluminiumfolie ein.
Schreiben Sie die Plot-IDs und die Platten-ID auf die Aluminiumfolie. Legen Sie die Platten für mindestens 30 Minuten in eine dunkle Box oder einen Schrank, um die ersten beiden Phasen des nicht-photochemischen Abschreckens zu entspannen. Verwenden Sie eine verlängerte dunkle Inkubationszeit von einer Stunde vor der Bildgebung, wenn Langzeitphasen des nicht-photochemischen Abschreckens von Interesse sind.
Bereiten Sie eine zusätzliche Dummy-Platte für die Fokussierung während der Analyse vor, indem Sie eine Blattscheibe in jede Ecke einer frischen 96-Well-Platte und eine in der Mitte legen. Sichern Sie die Blattscheiben mit Nasenfiltern wie bei früheren Platten, versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur und 50% relativer Luftfeuchtigkeit. Schalten Sie den Imager ein und öffnen Sie die Imaging-Software.
Klicken Sie auf Einstellungen gefolgt von Protokoll, um ein Fenster für die Eingabe von Schritten im experimentellen PAM-Protokoll zu öffnen. Legen Sie die technischen Spezifikationen der im Manuskript angegebenen Maschine fest. Stellen Sie das Programm so ein, dass es mit einem gesättigten Puls beginnt, um die maximale Quanteneffizienz der dunkelangepassten Photosynthese zu messen, indem Sie 20 Sekunden in das Feld Nach einer Verzögerung von eingeben.
Klicken Sie auf das Feld Impuls anwenden, und geben Sie 1 in das Feld Diese Anzahl von Malen ein. Stellen Sie den Puls-PPFD auf 6, 152, die Pulslänge auf 800 Millisekunden und aktivieren Sie das Kontrollkästchen F-Prime- und FM-Prime-Bilder mit allen Impulsen aufnehmen. Aktivieren Sie Einfügen nach, um dem Protokoll einen zweiten Schritt hinzuzufügen.
Geben Sie 30 Sekunden in das Feld Nach einer Verzögerung von ein. Wählen Sie dann die Option Aktinic ändern und geben Sie 50 in das Feld Actinic PPFD ein, um die Lichtintensität der Kammer auf 50 PPFD einzustellen. Klicken Sie auf Einfügen nach, um dem Protokoll einen neuen Schritt hinzuzufügen, und geben Sie 150 Sekunden in das Feld Nach einer Verzögerung von ein.
Wählen Sie Puls anwenden und geben Sie 4 in das Feld Diese Anzahl von Malen ein, um Messimpulse alle 150 Sekunden viermal hintereinander anzuwenden, während das aktinische Licht bei 50 PPFD gehalten wird. Passen Sie die Verzögerung und Lichtintensität für jeden Schritt entsprechend den im Manuskript angegebenen Werten an, bevor Sie das Protokoll als pcl-Datei am gewünschten Ort speichern. Schalten Sie das Licht aus und legen Sie die Dummy-Platte mit der Vorderseite nach unten auf den Probentisch, so dass die adaxiale Oberfläche des Blattes nach oben zum Detektor zeigt und der Schwamm nach unten zur Plattform zeigt.
Stellen Sie die Höhe des Probentisches so ein, dass sich die Blattscheiben 140 Millimeter über dem Sockel des Instruments befinden. Klicken Sie auf das Symbol Verbindung mit Imager-Kamera und Hardwarekamera verbinden/trennen, um die Kamera zu starten. Klicken Sie auf das Fokusfluoreszenzsymbol, dargestellt durch ein rotes, zweiseitiges Pfeilsymbol mit zwei grünen Linien an der Basis, und passen Sie das Objektiv und die Belichtung an, um die Platte in den Fokus zu bringen.
Klicken Sie erneut auf das Fokusfluoreszenzsymbol, um das blinkende Licht auszuschalten. Wenn Sie im Dunkeln arbeiten, ersetzen Sie die Dummy-Platte durch die zu analysierende Platte. Platzieren Sie es mit der Vorderseite nach unten mit dem Klebeband auf der Außenseite, das zum Ausrichten der oberen rechten Ecke verwendet wird, und klicken Sie auf das Kartenbild-Kamerasymbol.
Passen Sie die Bildbelichtung an, indem Sie die Blende öffnen oder schließen, bis die Leiste im Popup-Fenster im grünen Bereich positioniert ist. Klicken Sie nach jeder Einstellung der Blende auf die Schaltfläche "Erneut versuchen", bis die Belichtung korrekt eingestellt ist und das Instrument ein Bild aufnimmt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie Bildisolierung anwenden, um Hintergrundsignale zu blockieren.
Der fokussierte Blattbereich wird grau und der Hintergrund blau dargestellt. Wählen Sie den Bereich oder die gewünschten Pixel aus, um nur die Blattscheiben einzuschließen, indem Sie das Histogramm und den Gammapegel im Pulldown-Menü Bild ändern anpassen, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild klicken. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie Hohe und niedrige Schnitte löschen, um die hellblau hervorgehobenen Bereiche zu löschen.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie Streuner löschen, um alle Pixel zu entfernen, die die letzten drei anderen Pixel nicht berühren. Alle Bereiche auf dem Bild, die als isolierte Inseln erscheinen, werden separat analysiert und in die endgültige Datenausgabe aufgenommen. Klicken Sie auf das Symbol Protokoll ausführen, um das Programm zu starten.
Am unteren Bildschirmrand erscheint ein Timer, der Sie darüber informiert, wie lange das Protokoll noch läuft. Warten Sie, bis das Protokoll abgeschlossen ist. Klicken Sie auf Datei und Speichern unter, um die Daten als igr-Datei zu speichern.
Schließen Sie das Fenster, indem Sie auf das rote Kreuz oben rechts im Fenster klicken, bevor Sie eine weitere Musterplatte starten. Um die Chlorophyllfluoreszenzdaten zu exportieren, öffnen Sie die igr-Datei in der Bildgebungssoftware und klicken Sie auf Datei, gefolgt von In Ordner exportieren, um einen neuen Ordner mit allen erforderlichen Dateien zu erstellen. Eine typische Messung der nicht-photochemischen Abschreckung in Feldgezüchteten Sojabohnen zeigte, dass nach einem anfänglichen Sättigungsblitz zur Bestimmung von Fv / Fm, wenn die Blattscheiben einem schwachen Licht von 50 Mikromol pro Meter und Sekunde ausgesetzt wurden, die nicht-photochemische Abschreckung weniger als eins betrug.
Darüber hinaus erhöhte sich bei der Übertragung auf Hochlicht von 2.000 Mikromol pro Meter und Sekunde die nicht-photochemische Abschreckung nach 15 Minuten auf den Maximalwert von vier. Eine fehlgeschlagene Messung zeigte einen minimalen Anstieg der nicht-photochemischen Abschreckung bei der Übertragung auf hohes Licht. Die Ausrichtung der Platten innerhalb des Imagers und ein klar definierter Plan für die Probenahme und Beschichtung von Blattscheiben sind unerlässlich, um sicherzustellen, dass die Daten mit dem richtigen Genotyp verknüpft sind.
Dieses Protokoll kann die Auswirkungen von Umweltvariablen wie Dürre und Shedding auf das nicht-photochemische Abschrecken quantifizieren oder nicht-photochemische Abschreckungen auf verschiedenen Baldachinniveaus bewerten, um Pflanzenmodelle zu verfeinern.
