Dieses konfokalmikroskopische Protokoll wird die Interpretation des ökologischen Verhaltens und der Anpassungen von Mikroalgen aus extremen Umgebungen mit langsamem Wachstum im Labor unter Verwendung der Autofluoreszenz ihrer Pigmente ermöglichen. Diese Technik ist nicht invasiv und minimiert Artefakte, da keine chemischen Verbindungen verwendet werden. Die Kenntnis der Leistung von Pigmenten von Autotrophen und des entsprechenden Wachstums ermöglicht die Entwicklung der Kontrollmethoden, die für touristische Höhlen und Baudenkmäler von größtem Interesse sind.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Inokulums von Chroothece mobilis, indem Sie es aus der Agarkultur in das Meerwassermedium oder das flüssige SWES-Medium überführen. Halten Sie alle Kulturen zwei Wochen lang mit einer Fotoperiode von 16 bis 8 Helldunkel bei 20 Grad Celsius unter einer niedrigen Weißlichtintensität und ohne Schütteln aufrecht, bis die gewünschte Zelldichte erreicht ist. Verwenden Sie einen Milliliter der exponentiellen Phasenkultur mit fünf mal 10 bis dritten Zellen pro Milliliter Zelldichte, um in einer 24-Well-Platte für verschiedene Experimente zu impfen.
Um den monochromatischen Lichteffekt zu reproduzieren, verwenden Sie den Grünfilter, der grünes Licht von 470 bis 570 Nanometern mit einem Peak bei einer Wellenlänge von 506 Nanometern und rotem Licht mit einem Filter zwischen 590 und 720 Nanometern und Peaks bei 678 Nanometern durchlässt. Setzen Sie die Zellkulturen zwei Wochen lang diesem Licht aus. Schalten Sie alle Komponenten des inversen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops einschließlich des Lasers ein.
Montieren Sie die Zellen im SWES-Wachstumsmedium aus jeder experimentellen Vertiefung der 24-Well-Platte zur Bildgebung auf eine 35-Millimeter-Glasbodenschale. Wählen Sie das numerische Aperturobjektiv mit 63-facher oder 1,30-facher numerischer Apertur oder das NA-Glycerin-Immersionsobjektiv und platzieren Sie Glycerin über dem Objektiv. Legen Sie anschließend die Well-Platte auf den Mikroskoptisch, um sicherzustellen, dass sich die Probe während der Bildaufnahme nicht bewegt.
Zentrieren Sie die Probe im Lichtweg und fokussieren Sie auf das Zentrum der Zelle, indem Sie die Ebene mit der höchsten Fluoreszenzintensität auswählen. Wenn Sie fertig sind, öffnen Sie die Bilderfassungssoftware und wählen Sie XY Lambda aus der Dropdown-Liste im Aufnahmemodus. Wählen Sie die Anregungslinie des Lasers 561 Nanometer, acht Bit Dynamikumfang und 1024 x 1024 Pixel.
Sammeln Sie die Fluoreszenzemissionsspektren in der 10-Nanometer-Bandbreite und die Lambda-Schrittweite von vier Nanometern im Bereich von 570 bis 760 Nanometern. Stellen Sie die Lochblende auf eine Lufteinheit ein und führen Sie die Lambda-Scan-Erfassung durch. Nachdem Sie diesen Vorgang in verschiedenen Sichtfeldern und unter den unterschiedlichen Bedingungen von rotem und grünem Licht wiederholt haben, speichern Sie alle Daten.
Sobald der Lambda-Scan erfasst ist, klicken Sie auf das Quantifizierungsfenster oben in der Software, um die gesammelten Fluoreszenzemissionsspektren auszuwerten. Gehen Sie zum geöffneten Projektfenster und wählen Sie eine XY-Lambda-Datei aus. Wählen Sie die gestapelte Profilanalyse in der Bildgebungssoftware und definieren Sie einen interessierenden Bereich von vier Mikrometern im Quadrat in der Mitte einer Zelle, um die mittlere Fluoreszenzintensität zu analysieren.
Exportieren Sie die Daten und CSV, bevor Sie den Vorgang mit verschiedenen Zellen unter verschiedenen Bedingungen wiederholen. Öffnen Sie als Nächstes die CSV-Dateien, um die verschiedenen Fluoreszenzemissionsspitzen aller gemessenen Regionen von Interesse auszuwählen, indem Sie die maximalen Fluoreszenzdaten von Phycoerythrin, Phycocyanobilin, C.phycocyanin, Allophycocyanin bzw. Chlorophyll A in der CSV-Datei auswählen. Wenn Sie fertig sind, erstellen Sie eine neue Tabelle mit allen maximalen Fluoreszenzwerten, die von jedem Phycobiliprotein- und Chlorophyll-Peak erhalten wurden, und zeichnen Sie die Daten in einem Diagramm auf.
Es wurden signifikante Unterschiede in der mittleren Fluoreszenzintensität beobachtet. Die mittlere Fluoreszenzintensität von Phycoerythrin Phycocyanobilin nahm signifikant ab, wenn die Zellen monochromatischem grünem Licht ausgesetzt wurden. Im Gegensatz dazu wurde bei rotem Licht kein Unterschied im Vergleich zur Kontrolle beobachtet.
Das grüne Licht hatte den gegenteiligen Effekt auf Allophycocyanin und Chlorophyll A, bei denen die mittlere Fluoreszenzintensität unter anderem aufgrund der Anpassung von Antennenkomplexen aufgrund erhöhter Menge oder verbesserter Konnektivität der Antennenkomplexe signifikant zunahm. Das rote Licht führte zu einem nicht signifikanten Anstieg der Allophycocyanin- und Chlorophyllfluoreszenz. Um die Auswirkungen unterschiedlicher Wachstumsbedingungen auf Zellen in Kultur zu untersuchen, ist es wichtig, die Messungen mit genau den gleichen Mikroskopeinstellungen durchzuführen.
Es ist möglich, andere Umweltparameter zu analysieren, die für die Kultur von Autofluoreszenzorganismen relevant sind, sowie das Fluoreszenzsignal innerhalb des sichtbaren Spektrums. Diese Technik ist ein sehr leistungsfähiger Ansatz, um lebende Organismen mit mehreren Autofluoreszenzpigmenten zu untersuchen.
