Dieses Protokoll stellt das Verfahren von der Einzelzellamplifikation bis hin zu den endgültigen Berichtsdaten in der Präimplantationsdiagnostik auf Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Sequenzierungsplattform der nächsten Generation dar. Dieses Verfahren kann den Zuschauern helfen, den experimentellen Workflow der PGT-A-Sequenzierung gut zu verstehen und diese Technik in einem diagnostischen Labor mit einer halbleiterbasierten NGS-Plattform zu replizieren. Beginnen Sie damit, 25 Mikroliter der gesamten Genomamplifikationsprodukte zu pipettieren und sie in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu überführen, das mit 25 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser vorgeladen ist.
Wirbeln und mischen Sie die DNA-Reinigungsperlen. Aliquot 50 Mikroliter dieser Lösung in jedes Probenröhrchen. Vortex und Zentrifuge kurz für fünf Sekunden.
Stellen Sie das Röhrchen für fünf Minuten bei Raumtemperatur für den DNA-Bindungsprozess ein. Führen Sie das 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen in ein Magnetgestell ein. Warten Sie dann, bis alle magnetischen Perlen von der Seitenwand der Röhre angezogen werden.
Den Überstand vorsichtig in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Vermeiden Sie es, die Perlen auszupipettieren. Entsprechend dem ursprünglichen Probenvolumen.
Pipette 30 Mikroliter Magnetkügelchen, Wirbel und Zentrifuge kurz für fünf Sekunden. Stellen Sie das Röhrchen für fünf Minuten bei Raumtemperatur für den DNA-Bindungsprozess ein. Führen Sie die 1,5-Millimeter-Zentrifugenröhrchen in das Magnetgestell ein.
Warten Sie dann, bis alle magnetischen Perlen von der Seitenwand der Röhre angezogen werden. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren.
Pipettieren Sie 300 Mikroliter 70% Ethanol in das 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr. Drehen Sie das Rohr dann vorsichtig zweimal in einem 180-Grad-Winkel und bewegen Sie die Perlen entlang der Rohrwand für eine gründliche Wäsche. Pipettieren und entsorgen Sie den Überstand.
Vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren. Wiederholen Sie den Waschvorgang einmal. Setzen Sie eine neue Verstärkungsplatte in das System ein, sobald das saubere Programm abgeschlossen ist.
Führen Sie die mit jeweils 150 Mikrolitern vorgefüllten Sammelröhrchen Bruchlösung zwei in den Rotor ein und legen Sie dann die Brücke auf die Sammelrohre. Das Reaktionsöl in die Hälfte des Röhrchens und die Emulgatorbruchlösung in ein Drittel des Röhrchens geben. Platzieren Sie einen neuen Filter für die Schablonenvorbereitung auf einem Rohrgestell mit dem Probenportal nach oben.
Fünf Sekunden lang die Lösung durchwirbeln und fünf Sekunden lang kurz zentrifugieren. Anschließend wird die Lösung nach dreimaligem Pipettieren von 800 Mikrolitern in das Probenportal des Filters überführt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen, um Blasen vor der letzten Injektion zu verringern.
Vermeiden Sie es, Luft in den Filter einzublasen. Injizieren Sie 200 Mikroliter Reaktionsöl zwei, nach der gemischten Lösung. Drehen Sie das Probenportal des Filters nach unten und ersetzen Sie die Waschanlage durch den Filter.
Führen Sie die Probennadel in das mittlere Loch des Rotordeckels ein und drücken Sie die Nadel dann auf den Boden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen auf dem Bildschirm und wählen Sie das Programm entsprechend dem entsprechenden Kit aus. Wählen Sie dann Unterstützt, um alle Schritte zu überprüfen.
Klicken Sie auf Weiter, bis der Lauf gestartet ist. Der Lauf dauert ca. 4,5 Stunden. Wählen Sie Weiter, wenn das Programm beendet ist.
Das System startet einen 10-minütigen Zentrifugationsprozess. Klicken Sie nach der Zentrifugation auf die Schaltfläche Deckel öffnen und verschieben Sie die Sammelröhrchen in die Regale. Wenn der Vorgang nicht innerhalb von 15 Minuten zum nächsten Schritt übergeht, drücken Sie auf die letzte Drehung, um die Zentrifuge erneut zu zentrifugieren.
Entfernen Sie den Überstand im Sammelröhrchen und lassen Sie 100 Mikroliter Lösung im Röhrchen. Mischen Sie die verbleibende Probe durch Pipettieren und überführen Sie die Probe in das neue 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung OT. Vermeiden Sie beim Pipettieren des Überstandes, den Boden des Röhrchens an den Seiten zu berühren. Pipettieren Sie 100 Mikroliter nukleasefreies Wasser in jedes Sammelröhrchen und geben Sie die Lösung durch wiederholtes Pipettieren in das OT-Röhrchen, das gewaschen wird.
Fügen Sie 600 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die OT-Röhre hinzu, um das Gesamtvolumen von einem Milliliter zu erhalten. Wirbel für 30 Sekunden in Zentrifuge bei 15, 500 mal G für acht Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und lassen Sie 100 Mikroliter Lösung im OT-Röhrchen zurück.
Verwenden Sie die Spitze, um die Ölschicht vollständig zu entsorgen. Fügen Sie 900 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu, wirbeln Sie für 30 Sekunden und zentrifugieren Sie bei 15, 500 mal G für acht Minuten. Entfernen Sie den Überstand, bis 20 Mikroliter der Lösung übrig sind, und fügen Sie die Schablonenlösung hinzu, um das Volumen von 100 Mikrolitern zu erhalten.
Dann 30 Sekunden lang vortex und zwei Sekunden lang kurz zentrifugieren. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt innerhalb von 12 Stunden nach der Probenverarbeitung fort Laden Sie 100 Mikroliter der verdünnten Bibliothek, 130 Mikroliter C1-Perlen, 300 Mikroliter drei x Schablonenwaschlösung und 300 Mikroliter der Abschmelzlösung in die acht Vertiefungsstreifen. Installieren Sie die acht Well-Streifen auf dem Anreicherungsmodul, laden Sie die Pipettierspitze und stellen Sie das 200-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen in die Sammelposition.
Klicken Sie auf Start, um das Programm auszuführen. Pipettieren Sie 55 Mikroliter der Probenlösung und injizieren Sie sie in das Probenloch des Chips. Setzen Sie den Chip auf die Zentrifuge.
Halten Sie die Kerbe nach außen und das Probenportal nach innen. Dann balancieren Sie es mit einem anderen gebrauchten Chip aus und zentrifugieren Sie es für 10 Minuten. Bereiten Sie die Ladelösung wie im Textmanuskript beschrieben vor.
Blasen Sie 100 Mikroliter Luft in die Schaumlösung. Pipettieren Sie die Lösung wiederholt, bis die Blasen in einem dichten, schäumenden Zustand sind, und halten Sie das Schaumvolumen auf etwa 250 Mikroliter. Legen Sie den Chip nach der Zentrifuge auf die Bank.
Injizieren Sie 100 Mikroliter Schaum in das Probenloch und entfernen Sie die extrudierte Lösung in das Ausgangsportal. Dann zentrifugieren Sie den Chip kurz für 30 Sekunden. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal.
Injizieren Sie zweimal 100 Mikroliter bei 50% Waschpuffer und entfernen Sie die extrudierte Lösung nach jeder Injektion in das Ausgangsportal. Dann injizieren Sie dreimal 100 Mikroliter bei 50% Glühpuffer und entfernen Sie die extrudierte Lösung nach jeder Injektion in das Ausgangsportal. Injizieren Sie 65 Mikroliter bei 50% Enzymreaktionspuffer, vermeiden Sie Blasen und entfernen Sie die extrudierte Lösung im Außenportal.
Stabilisieren Sie den geladenen Chip fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und installieren Sie den Chip auf dem Sequenzer-Chipportal. Wählen Sie das Programm Geplant, überprüfen Sie die Informationen und starten Sie den Lauf. Der repräsentative Lauf erhielt insgesamt 17,6 Gigabyte Daten und die Gesamtladerate des Ionenkugelpartikels betrug 88% in den Gesamttöpfen des Chips.
Die Heatmap bestätigte sogar die Probenbeladung auf der gesamten Chipfläche. 77% der gesamten Lesevorgänge waren verwendbar. Alle mit ISP beladenen Wells zeigten eine Anreicherung von 100%Vorlagen, wobei 78% klonal waren.
Von allen klonalen Vorlagen wurden 97% als endgültige Bibliothek qualifiziert. Die durchschnittliche Länge des Lesevorgangs betrug 177 Basenpaare, während der Median und der Modus 176 bzw. 174 Basenpaare betrugen. Die Spitzenwerte von Thymin, Cytosin und Adenin in den Vorlagen lagen etwa 76 über der qualifizierten Cutoff-Linie von 50.
In allen adressierbaren Wells mit Live-ISPs wurden 99,5% als konstruierte Bibliothek qualifiziert und 20% der polyklonalen und minderwertigen Bibliotheken herausgefiltert, während 76,6% der ISPs für weitere Analysen qualifiziert waren. Das Ergebnis der Kopienzahlvarianz aus einer einzelnen Probe zeigte eine 182,16 Megabasenpaare Mosaiktrisomie von P 16,3 bis Q 35,2 auf Chromosom vier und ein 33 Punkt 13 Megabasenpaare Monosomiesegment von Q 11,1 bis Q 13,33 auf Chromosom 22. Bei der Fragmentauswahl sollten die Zeitintervalle zwischen den Schritten entsprechend der Größe der Proben in derselben Charge geändert werden, um eine Über- und Nichtbelichtung für Front- und Heckproben zu vermeiden.
