Dieses Protokoll ermöglicht es, das Potenzial und die Fähigkeit von Muller-Gliazellen zu untersuchen, sich nach der Behandlung mit spezifischen Faktoren wie microRNAs in retinale Vorläuferzellen umzuwandeln. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass microRNA-Kandidaten vor ihrer Verwendung in In-vivo-Anwendungen auf ihre Effizienz und ihr Ergebnis getestet werden können. Bei der Demonstration des Verfahrens hilft Seoyoung Kang, Doktorandin aus dem Labor von Stefanie Wohl.
Tauchen Sie zuerst den entfernten Augapfel kurz in ein Röhrchen mit Ethanol, um die Verschleppung von Bakterien aus dem Tier zu vermeiden. Dann waschen Sie den Augapfel kurz in der 10 Zentimeter großen Petrischale, bevor Sie ihn in die 24-Well-Platte auf Eis legen. Sobald die Augäpfel entfernt und gereinigt sind, legen Sie ein Auge in die Präzierschale, die unter einem Seziermikroskop mit einer Lichtquelle platziert ist.
Befestigen Sie nun einen Augapfel, indem Sie den Sehnerv und das umgebende Bindegewebe um die Sklera mit einer Dumont 5 feinen Pinzette greifen und vorsichtig gegen die Präzierschale drücken. Als nächstes machen Sie ein Loch in der Hornhautmitte mit einer 30-Gauge-Nadel, um einen leichteren Zugang für die Venenschere zu ermöglichen. Dann sezieren Sie die Hornhaut um den Ziliarkörper mit einer Venenschere und entfernen Sie Hornhaut, Linse, Iris und Glaskörper vorsichtig mit Dumont 5 feiner Pinzette.
Später sezieren Sie die Sklera mit einer Venenschere, bis der Sehnerv erreicht ist, und extrahieren Sie die Netzhaut vorsichtig mit einer feinen Pinzette Dumont 5. Verwenden Sie nun eine zweite Dumont 5 feine Pinzette, um gegen die Netzhaut zu drücken und den Glaskörper vollständig zu entfernen. Übertragen Sie die Netzhaut, die etwa 2,5 Zentimeter von der Spitze einer sterilen Transferpipette geschnitten wird, um den Durchmesser zu vergrößern.
Nehmen Sie nun mit diesem Tipp ganze Netzhäute auf, ohne das Gewebe zu beschädigen, und übertragen Sie die Netzhaut in eine neue sterile Petrischale mit kaltem HBSS und rocken Sie die Schale. Als nächstes schieben Sie die Netzhaut mit einer neuen sterilen Transferpipette vorsichtig herum, um die Netzhautpigmentepithelzellen abzuwaschen. Legen Sie die isolierte Netzhaut sofort in eine neue saubere Vertiefung der 24-Well-Platte, die mit einem Milliliter HBSS gefüllt ist, während Sie die 24-Well-Platte während der Dissektion auf dem Eis halten.
Bereiten Sie die Papain-DNase-I-Dissoziationsmischung wie im Manuskript beschrieben vor. Nehmen Sie nun mit einer vergrößerten Spitzentransferpipette die Netzhaut auf. Warten Sie, bis sich die Netzhaut an der Unterseite der Spitze abgesetzt hat, und geben Sie die Netzhaut ohne übermäßiges HBSS in das Röhrchen frei, das die Papain-DNase-I-Mischung enthält.
Als nächstes legen Sie das Röhrchen auf einen Nutator im Inkubator und inkubieren für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und mit 5% Kohlendioxid. Als nächstes dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren. Nachdem die Zellen dissoziiert sind, fügen Sie 275 Mikroliter ovomucoiden Proteaseinhibitor aus dem Papain-Dissoziationskit hinzu, um den Papain zu neutralisieren, und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren auf und ab.
Röhrchen in eine Zentrifuge geben und acht Minuten lang bei vier Grad Celsius bei einer relativen Zentrifugalkraft von 300 drehen. Fügen Sie dem berechneten Volumen des bei 37 Grad Celsius vorgewärmten Wachstumsmediums den epidermalen Wachstumsfaktor hinzu. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge.
Ohne das Pellet am Boden des Röhrchens zu berühren, entfernen Sie den Überstand vorsichtig und vollständig. Nun resuspendieren Sie das Zellpellet mit 500 Mikrolitern epidermalen Wachstumsfaktor ergänzt Wachstumsmedium. Dann wird die Zellsuspension in eine Vertiefung der beschrifteten 12-Well-Platte überführt.
Spülen Sie das Röhrchen mit weiteren 500 Mikrolitern des mit epidermalen Wachstumsfaktor ergänzten Wachstumsmediums und fügen Sie es dem Brunnen hinzu. Schütteln Sie die Brunnenplatte vorsichtig und legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit Kohlendioxid in den Inkubator. Beginnen Sie mit der Überprüfung auf 90% bis 100% Zellkonfluenz.
Als nächstes entfernen Sie das Medium und fügen Sie einen Milliliter kaltes HBSS hinzu, um den Brunnen zu waschen. Schaukeln Sie vorsichtig die Platte und entfernen Sie HBSS ohne Spuren hinterlassen. Später fügen Sie 500 Mikroliter einer vorgewärmten Trypsin-haltigen Lösung hinzu, um die Zellen aus dem Brunnen zu lösen.
Schaukeln Sie vorsichtig und inkubieren Sie für zwei Minuten im 37 Grad Celsius Inkubator. Nachdem Sie die Platte vom Inkubator in die Biosicherheitswerkbank gebracht haben, saugen Sie die trypsinhaltige Lösung beim Kippen ab. Verteilen Sie es vorsichtig und langsam mehrmals über den Brunnen, bis sich die Zellen vollständig lösen.
Als nächstes übertragen Sie diese Zellsuspension in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen und legen Röhrchen in die Zentrifuge. Bei 300 mal g acht Minuten bei vier Grad Celsius schleudern und Röhrchen zurück in die Biosicherheitswerkbank bringen. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu berühren.
Resuspendieren Sie nun vorsichtig das Zellpellet, indem Sie 600 Mikroliter vorgewärmtes Wachstumsmedium hinzufügen und etwa 30 bis 40 Mal auf und ab pipettieren. Schließlich werden 100 Mikroliter der erhaltenen Zellsuspension in der Mitte von sechs beschichteten Deckgläsern der 24-Well-Platte ausgesät. Legen Sie die Platte auf den Inkubator und lassen Sie die Zellen für die anschließende Transfektion mit Mikro-RNA-Nachahmungen absetzen.
Die Abbildung zeigt die Kontrollbedingungen fünf Tage nach der Transfektion mit einigen Ascl1-Tomato-positiven Zellen. Nach einer miR-25-Behandlung werden jedoch noch viel mehr Ascl1-Tomato-positive Zellen gefunden. Die Quantifizierung ergab eine Vervierfachung der Anzahl der Ascl1-Tomato-positiven Zellen in den miR-25-behandelten Vertiefungen im Vergleich zu Kontrollen.
Am wichtigsten ist, dass die überwiegende Mehrheit der Ascl1-Tomato-positiven Zellen, die in den mit riR-25 behandelten Wells gefunden wurden, eine neuronale Morphologie annahm. Zu den Merkmalen dieser neuronalen Morphologie gehörten eine reduzierte Zellsomagröße, die Entwicklung feiner Prozesse und die Bildung winziger Netzwerke. Die Quantifizierung ergab, dass etwa 70% aller Ascl1-Tomato-positiven Zellen neuronale Merkmale aufwiesen.
Die immunfluoreszierende Markierung zeigt, dass Ascl1-Tomato-positive Zellen mit neuronaler Morphologie die neuronalen Marker OTX2 und MAP2 exprimieren, was die neuronale Identität bestätigt. Die Quantifizierung dieser Zellen zeigte, dass nach miR-25-Überexpression etwa 40 Ascl1-Tomato-positive Neuronen pro Feld vorhanden sind, verglichen mit fünf neuronalen Zellen pro Feld in Kontrollen. Die identifizierten neuronalen Zellen machen etwa 70% der gesamten Ascl1-Tomato-positiven Zellpopulation der miR-25-behandelten Proben aus.
Darüber hinaus zeigte die Quantifizierung der absoluten Anzahl von OTX2- und MAP2-koexprimierenden Neuronen, dass nach miR-25-Behandlung etwa 60 Neuronen pro Feld gefunden wurden, verglichen mit 10 Neuronen pro Feld bei Kontrollen. Es ist unerlässlich, in einer sauberen und desinfizierten Umgebung mit sauberen und sterilen Werkzeugen zu arbeiten und sorgfältig zu arbeiten, indem jede harte Behandlung vermieden wird. Nachgelagerte Anwendungen können beispielsweise Proteinquantifizierung, DNA- oder RNA-Analyse oder elektrophysiologische Studien sein.
Diese Technik half uns, erste Fragen zur nuklearen Reprogrammierung zu erforschen, die zum Bereich der regenerativen Medizin gehört. Und es gibt eine Vielzahl von Faktoren und Bedingungen, die getestet werden können, um neue Fragen zu erforschen.
