Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist es, primäre Mikrogliazellen aus lebenden erwachsenen menschlichen Hirngeweben zu isolieren. In unserem Fall wurde dies als chirurgisches Fenster während der Operation gesammelt. Dies wird durch das zuerst sammeln des Gehirngewebes in eiskalten PBS erreicht, das Gewebe wird dann in 1-mm-Würfel kleine Stücke gewürfelt, und ich habe gerade mit Hilfe von Trypsin EDTA.
Danach werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und 48 Stunden lang in einem Kolben plattiert, der für die Androgenzellkultur geeignet ist. Die Zellen werden wieder aus dem Kolben geerntet und bis zur weiteren Verwendung kultiviert. Primäre menschliche Mikrogliazellen können nun durch Immunzytochemie charakterisiert und für weitere Experimente verwendet werden.
Der Hauptvorteil unseres Protokolls zur Isolierung von Mikrogliazellen aus adulten menschlichen Hirngeweben besteht darin, dass es die primären adulten menschlichen Mikrogliazellen effektiv auf sehr kostengünstige Weise bereitstellt. Das Protokoll ist robust und reduziert den Zellverlust, indem es die Anzahl der Schritte reduziert, die in vorhandenen Protokollen verwendet werden. Sammeln Sie das Gewebe in einem 50-ml Falcon-Rohr mit 10 ml eiskaltem aCSF.
Wischen Sie das Sammelrohr sorgfältig mit 70% Alkohol ab und übertragen Sie es in eine aseptische laminare Luftstromkammer. Entsorgen Sie das aCSF sorgfältig und wiegen Sie Gewebe in der Falcon-Röhre. Berechnen Sie das ungefähre Gewicht des Gewebes, indem Sie das Gewicht des leeren Falcon-Rohrs ableiten.
Warm frisch aCSF bis 37 Grad Celsius. Halten Sie das Gewebe fünf Minuten lang in warmem ACSF auf. Dieser Schritt ist entscheidend, um den Zelltod zu vermeiden.
Entsorgen Sie aCSF sorgfältig. Und waschen Gewebe einmal mit 1X PBS erwärmt auf 37 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Blut bei Bedarf mit wiederholten PBS-Waschungen weggespült wird.
Inkubieren Sie das Gewebe in warmen PBS für 5 Minuten. Entsorgen Sie die Hälfte der PBS sorgfältig. Übertragen Sie Gewebe zusammen mit den verbleibenden PBS in eine sterilisierte Petrischale.
Entfernen Sie die verbleibendePBS sorgfältig mit 1-ml Pipette. Dies verhindert den Verlust von Gewebe. Würfel, die mit einem sterilen Skalpell in mindestens 1-mm-Würfel kleine Stücke würfeln.
Fügen Sie 2 ml 0,25%Trypsin EDTA in die Petrischale und waschen Sie den Teller gründlich mit Hilfe von Pipette. Übertragen Sie das gewürfelte Gewebe in ein 50-ml Falcon-Rohr mit 10 ml pro Gramm Gewebe von 0,25%Trypsin EDTA. Mischen Sie durch Pipettieren durch eine 10-ml-Serologische Pipette.
Inkubieren Sie die Röhre auf einem Shaker für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und der Geschwindigkeit von 250 U/min. Fügen Sie 10 ml neutralisierendes Medium hinzu, um Trypsin zu neutralisieren. Mit einer 10-ml-Serologischen Pipette gründlich mischen.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 2000G bei 4 Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml Kulturmedium wieder auf. Legen Sie die Zellen in einem T25-Kolben, der für Androgenzellen geeignet ist, und fügen Sie 4 ml zusätzliches Kulturmedium hinzu.
Kulturmedium wird 20%L929 Überstand und 1%Streptomycin enthalten. Es wird empfohlen, L929 Überstand separat in Kolben hinzuzufügen, anstatt das Stoffkulturmedium hinzuzufügen. Wir sind mit dem Kolben fertig, um das Gewebe homogen zu entsorgen.
Vermeiden Sie es, die Medien beim Schütteln an den Hals des Kolbens zu bringen, da dies die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination erhöhen kann. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 für 48 Stunden. Sammeln Sie die Medien aus T25 Kulturkolben am Tag 0 in Zentrifugenröhren vorbereitet.
Zentrifuge die gesammelten Medien bei 1, 466G bei 4 Grad Celsius für 4 Minuten. Während die gesammelten Medien zentrifugiert werden, waschen Sie den Tag 0 Kolben einmal mit 1X PBS. Schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um alle restlichen Gewebefragmente zu entfernen.
Vermeiden Sie ein hartes Schütteln des Kolbens, da Restfragmente die Kultur nicht beeinträchtigen. Fügen Sie 5 ml frische Kulturmedien in den Kolben. Entsorgen Sie den Überstand aus zentrifugierten Rohren.
1 ml Kulturmedium in eines der Rohre geben und gründlich mit Pipette mischen. Serial fügen Sie das Mischmedium mit Zellen zu anderen Röhren und mischen gründlich. Legen Sie die Zellen in einem separaten T25-Kolben, der für Androgenzellen geeignet ist.
Fügen Sie 4 ml frische Kulturmedien in den Kolben. Inkubieren Sie beide Kolben bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 für 48 Stunden. Entsorgen Sie die Medien aus beiden Kolben, und fügen Sie neue 5 ml Kulturmedien hinzu.
Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius bei 5% CO2 für 48 Stunden. Am sechsten Tag werden die Zellen für weitere Experimente bereit sein. In den hier dargestellten Bildern.
Erste Platte des Abschnitts A Astrozyten mit GFAP gebeizt, grün in der Farbe. Im zweiten Panel, Abschnitt A Mikroglia Fleck mit RCA, grün in der Farbe. Im Abschnitt B Mikroglia mit RCA gefärbt, die grün in der Farbe ist, und Astrozyten sind mit GFAP, rot in der Farbe gefärbt.
Die Überlagerung der Bilder zeigt Mikroglia und Astrozyten zusammen. Aus den Bildern geht klar hervor, dass die Mehrheit der Zellen in der vorbereiteten Kultur Mikroglia sind. Die Bilder wurden durch geblendete Kontrolle quantifiziert und das Ergebnis wird in Abschnitt C dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass etwa 80% der Zellen in der vorbereiteten Kultur Mikrogliazellen sind.
Diese Technik kann in etwa eineinhalb Stunden durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren sollte ein gutes Verständnis dafür haben, wie ich Grundierung Mikroglia aus erwachsenen menschlichen Gehirngeweben, die weiter für nachgelagerte Experimente verwendet werden kann wählen.
