Dieses Protokoll beschreibt alle experimentellen Verfahren, vom Epitop-Tagging von Transkriptionsfaktor-kodierenden Genen über die computergestützte Datenanalyse bis hin zur genomweiten Profilierung von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen in Candida albicans über CUT&RUN. Dies ist eine zugänglichere, schnellere, empfindlichere, kostengünstigere Technik und liefert qualitativ hochwertigere Daten als herkömmliche ChIP-Chip- und ChIP-seq-Ansätze. Obwohl unser Protokoll für Candida albicans-Zellen entwickelt wurde, die aus Biofilmen oder Planktonkulturen isoliert wurden, sollte es praktisch sein, es an praktisch jede gute Form von Candida albicans-Zellen anzupassen.
Nach der Inkubation der Zellsuspension ein Fünf-Mikroliter-Aliquot in ein neues PCR-Röhrchen überführen. Zu fünf Mikrolitern isolierter Kerne und einem Fünf-Mikroliter-Aliquot intakter Zellen, die zuvor bei vier Grad Celsius gelagert wurden, fügen Sie je einen Mikroliter Calcofluor-White und SYTO 13 hinzu. 30 Minuten bei 30 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.
Untersuchen Sie die Integrität und Reinheit der isolierten Kerne visuell mit einem Fluoreszenzmikroskop. Suchen Sie nach isolierten Kernen, die eine prominente SYTO 13-Färbung aufweisen, und stellen Sie sicher, dass keine Zellwandfärbung durch den kalcofluorweißen Farbstoff erfolgt. Wiederholen Sie die Inspektion mit intakten Zellen als Kontrolle für die Zellwandfärbung mit kalcofluorweißem Farbstoff.
Legen Sie die Rohre auf ein Magnetgestell und warten Sie, bis die Aufschlämmung vollständig klar ist. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Fügen Sie 50 Mikroliter des Antikörperpuffers hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren.
Fügen Sie drei Mikroliter des polyklonalen Anti-GFP-Antikörpers zu den Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen auf einem Nutmischer bei 4 Grad Celsius für zwei Stunden. Zentrieren Sie die Röhrchen kurz bei 100 mal g bei Raumtemperatur für fünf Sekunden und legen Sie die Röhrchen auf ein Magnetgestell. Sobald die Gülle klar ist, entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
Während sich die Röhrchen mit den Perlen noch auf dem Magnetgestell befinden, fügen Sie 200 Mikroliter eiskalten Zellpermeabilisierungspuffer direkt auf die Perlen hinzu. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie zwei Wäschen mit dem eiskalten Zellpermeabilisierungspuffer.
Fügen Sie 50 Mikroliter eiskalten Zellpermeabilisierungspuffer zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. 2,5 Mikroliter des Proteins AG-MNase zu jeder Probe geben und durch Pipettieren mischen. Legen Sie die Proben bei 4 Grad Celsius auf einen Nutenmischer und inkubieren Sie die Proben für eine Stunde.
Die Bandröhrchen bei Raumtemperatur fünf Sekunden lang kurz mit 100 mal g zentrifugieren und dann auf ein Magnetgestell legen. Sobald die Gülle klar ist, entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Während sich die Röhrchen mit den Perlen noch auf dem Magnetgestell befinden, fügen Sie 200 Mikroliter eiskalten Zellpermeabilisierungspuffer direkt auf die Perlen hinzu.
Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie zwei Wäschen mit dem eiskalten Zellpermeabilisierungspuffer. Fügen Sie 100 Mikroliter des eiskalten Zellpermeabilisierungspuffers zu den Proben hinzu und pipettieren Sie fünfmal vorsichtig auf und ab.
Entfernen Sie den Gelguss aus der Gelbox und öffnen Sie den Gelguss gemäß den Anweisungen des Herstellers. Entfernen Sie das Gel vorsichtig aus dem Gelguss und legen Sie es in eine gelhaltende Schale mit 100 Millilitern einstärkendem FSME. 10 Mikroliter des Nukleinsäuregel-Flecks in die Schale geben und vorsichtig schwenken.
Zum Schutz vor Licht mit Folie abdecken und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang statisch inkubieren. Dann spülen Sie das Gel zweimal mit 100 Milliliter deionisiertem Leitungswasser ab. Stellen Sie das Gel unter blauer Lichtbeleuchtung mit einer gelben Filterabdeckung dar.
Für jede Bibliothek schneiden Sie das Gel leicht über das etwa 125 Basenpaar prominente Adapterdimerband und unterhalb der 400 Basenpaarleitermarke. Durchstechen Sie den Boden eines 0,65-Milliliter-Röhrchens mit einer 22-Gauge-Nadel und legen Sie das punktierte Rohr in ein steriles Zwei-Milliliter-Mikrofugenröhrchen. Übertragen Sie die Gelscheibe auf das punktierte Röhrchen im Zwei-Milliliter-Mikrofugenröhrchen.
Zentrifugieren Sie das Zwei-Milliliter-Mikrofugenröhrchen, das das 0,65-Milliliter-Punktionsröhrchen enthält, und entnehmen Sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur 10.000 g die Probe, um die Gelaufschlämmung im Zwei-Milliliter-Mikrofugenröhrchen zu sammeln. 300 Mikroliter eiskalten Gel-Elutionspuffer in die Gel-Aufschlämmung geben. Mischen Sie auf einem Nutator bei Raumtemperatur für mindestens drei Stunden oder über Nacht.
Gesamte Flüssigkeits- und Gelaufschlämmung in eine 0,22 Mikrometer große Filtersäule und Zentrifuge bei 10.000 mal g bei Raumtemperatur für eine Minute geben. Laden Sie den Quellcode für die CUT&RUN-Analyse von der GitHub-Seite herunter, indem Sie auf die grüne Schaltfläche Code klicken, gefolgt von der Option ZIP herunterladen. Entpacken Sie den Ordner an einen relevanten Speicherort auf dem lokalen Computer.
Installieren Sie Conda Environment und führen Sie es nur einmal aus. Sobald Conda installiert ist, erstellen Sie eine virtuelle Umgebung, die mit dem entsprechenden Befehl bereitgestellt wird. Aktivieren Sie die virtuelle Umgebung jedes Mal, wenn dieser Workflow ausgeführt wird.
Der Zellwandaufschluss und die nukleare Integrität wurden bewertet, indem sowohl intakte Zellen als auch isolierte Kerne sichtbar gemacht wurden, die mit fluoreszierenden Zellwand- und Nukleinsäurefärbungen angefärbt waren. Im Gegensatz zu den isolierten intakten Kernen, bei denen keine Zellwandfärbung beobachtet wird, sind sowohl die Kerne als auch die Zellwände in den intakten Kontrollzellen fluoreszierend markiert. Die Abbildung zeigt CUT&RUN TF-Bibliotheken, die mit einem Kapillarelektrophorese-Instrument analysiert wurden.
Erfolgreiche CUT&RUN TF-Bibliotheken sind für kurze Fragmente kleiner als 200 Basenpaare angereichert. Suboptimale CUT&RUN TF-Bibliotheken zeigen eine Anreicherung für große DNA-Fragmente. Die Abbildung hierin zeigt, dass Ndt80-DNA-bindende Motive über alle von CUT&RUN identifizierten Ndt80-gebundenen Loci angereichert sind, was darauf hindeutet, dass die zusätzlichen Peaks, die mit dieser Methodik identifiziert wurden, wahrscheinlich bonafide Ndt80-gebundene Sites sind.
Vergleichende Analysen zeigten, dass das CUT&RUN-Protokoll die meisten der bisher bekannten Bindungsereignisse für Ndt80 und Efg1 während der Biofilmbildung identifizierte. Insgesamt überschneiden sich sowohl Ndt80 als auch Efg1, die an Loci gebunden sind, mit zuvor veröffentlichten ChIP-Daten zur Chromatin-Immunpräzipitation und werden nur mithilfe von CUT&RUN identifiziert. Es ermöglicht uns, den Umfang und das Tempo unserer Forschung, die sich auf transkriptionelle regulatorische Netzwerke und Candida albicans konzentriert, deutlich zu erhöhen.
