Diese Methode wird es dem Forscher ermöglichen, schwer zu untersuchende Systeme wie Peptide und Übergangsmetallionen der ersten Reihe zu untersuchen, die beide im Allgemeinen mit Standardanwendungen eine Herausforderung darstellen. Der Hauptvorteil hierbei ist die Verwendung orthogonaler Techniken, da sie sich gut ergänzen und uns mehr Einblick in das System geben und uns helfen können, kein Phänomen zu übersehen. Die in diesem Video beschriebene Methode eignet sich sehr gut, um andere Systeme zu untersuchen.
Obwohl wir es mit Cu(II) und einem Peptid zeigen, kann es für viele verschiedene Metallpeptid- und Metallproteininteraktionen verwendet werden. Ich denke, der schwierigste Teil wird sein, eine gute Pufferwahl für Ihr Metallion und Peptid zu finden. Ich würde Literatur konsultieren, um zu sehen, welche Puffer zuvor von anderen verwendet wurden.
Sohee Choi, eine Doktorandin in meinem Forschungslabor, demonstriert das Verfahren. Schalten Sie zunächst das elektronische Absorptionsspektralphotometer ein und lassen Sie es vor Gebrauch etwa 15 bis 20 Minuten erwärmen. Starten Sie dann die Spektralphotometer-Software und konfigurieren Sie die Parameter, z. B. den Scanbereich von 200 bis 900 Nanometern, den Scanbereich von 200 Nanometern pro Sekunde und die korrigierte Doppelstrahl-Baseline.
Als nächstes sammeln Sie eine Basislinie ohne Küvetten oder Proben in den Strahlgängen. Verwenden Sie zwei aufeinander abgestimmte Küvetten im Doppelstrahl-Spektralphotometer, laden Sie eine Küvette mit 115 Mikrolitern Reinstwasser und die andere Küvette mit 115 Mikrolitern der Peptidprobe, wobei Sie sicherstellen, dass sich keine Luftblasen in den Küvetten befinden, da diese das Signal stören. Anschließend legen Sie die Küvette mit Reinstwasser in den Referenzstrahl und die Küvette mit Peptid in den Probenstrahl.
Dann sammeln Sie das Absorptionsspektrum des metallfreien Peptids. Geben Sie eine substöchiometrische Menge der Cu(II)-Lösung in die Küvette mit der Peptidprobe und notieren Sie das Volumen für die spätere Analyse. Leiten Sie das vorsichtig auf und ab, um die Lösung zu mischen und gleichzeitig die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
Nach fünfminütiger Äquilibrierung die Küvette wieder in den Probenzellenhalter geben und das Absorptionsspektrum aufzeichnen. Wiederholen Sie dann die Zugabe von Cu(II)aliquots in die Peptidlösung für verschiedene Äquivalente und notieren Sie das Gesamtvolumen von Cu(II)zugabe in die Küvette. Nach der Initialisierung der Software wie zuvor beschrieben in zwei aufeinander abgestimmten Küvetten laden Sie eine Küvette mit 115 Mikrolitern Reinstwasser und eine andere Küvette mit 115 Mikrolitern der Kupfer-Phen-Komplexlösung.
Legen Sie die Küvette mit Wasser in den Referenzstrahl und die Küvette mit Kupfer-Phen-Komplexlösung in den Probenstrahl. Dann sammeln Sie das Absorptionsspektrum des Metallligandenkomplexes. Danach fügen Sie der Kupfer-Phen-Komplexlösung eine stöchiometrische Menge Peptid hinzu und leiten Sie diese vorsichtig auf und ab, um gründlich zu mischen, wobei Sie darauf achten, keine Luftblasen einzuführen.
Als nächstes inkubieren Sie die Lösung für fünf Minuten, um das Gleichgewicht zu erreichen. Stecken Sie die Küvette wieder in den Probenzellenhalter und notieren Sie das Absorptionsspektrum. Wiederholen Sie später die Zugabe von Peptidaliquoten in die Kupfer-Phen-Komplexlösung für verschiedene Äquivalente und notieren Sie das Volumen des hinzugefügten Peptids, damit die verdünnte Konzentration bestimmt werden kann.
Schalten Sie zuerst die ITC ein und starten Sie die ITC-Software, um das Gerät auszuführen. Nach der ersten Initialisierung die Bürette wieder nach Hause nehmen und den Anweisungen auf dem Bildschirm folgen. Entfernen Sie dann die Bürette und die Abdeckung von der Referenzzelle.
Als nächstes entfernen Sie Wasser aus der Referenzzelle und spülen Sie dreimal mit 450 Mikrolitern entgastem Reinstwasser. Ziehen Sie langsam Reinstwasser bis zur 450-Mikroliter-Marke einer Ladespritze auf und achten Sie darauf, keine Luftblasen in die Spritze einzuführen. Führen Sie dann die Ladespritze in die Referenzzelle ein, bis sie etwa einen Millimeter vom Boden entfernt ist, und injizieren Sie langsam einen Teil der Lösung, bis 150 Mikroliter in der Ladespritze verbleiben.
Anschließend bewegen Sie den Spritzenkolben schnell um ca. 25 Mikroliter auf und ab, um Blasen auf der Zelloberfläche zu entfernen. Anschließend langsam injizieren, bis der Kolben die 100-Mikroliter-Marke auf der Ladespritze erreicht, dabei insgesamt 350 Mikroliter Reinstwasser in die Referenzzelle abgeben und die Referenzzellenabdeckung austauschen. Nach dem Entfernen der Restlösung aus der Probenzelle 450 Mikroliter 10 Millimolar EDTA mit einer Ladespritze laden und 10 Minuten einweichen, um sicherzustellen, dass Spurenmetallionen entfernt werden, da das EDTA Spurenmetalle bindet.
Nach dem Entfernen der EDTA-Lösung spülen Sie die Ladespritze gründlich mit reichlich Reinstwasser ab. Reinigen Sie die ITC gemäß den Anweisungen des Herstellers, indem Sie die Probenzelle mit Reinstwasser spülen. Entfernen Sie Restwasser aus der Probenzelle und konditionieren Sie die Probenzelle dann mindestens dreimal mit 450 Mikrolitern Puffer.
Als nächstes entfernen Sie den Restpuffer, der die Probenzelle konditioniert, und laden die Peptidlösung mit der Ladespritze in die Probenzelle. Spülen Sie dann die Titrationsspritze mit 200 Mikrolitern der gepufferten Lösung, indem Sie zuerst den Kolben entfernen. Pipettieren Sie die Pufferlösung mit einer Mikropipette durch das Loch oben in der Glastitrationsspritze durch die Spritze und aus der Nadel darunter.
Führen Sie später den Kolben vollständig in die Titrationsspritze ein. Tauchen Sie dann die Spitze der Titrationsspritzennadel in die Metalllösung und ziehen Sie den Kolben langsam nach oben, wodurch die Metalllösung die Spritze füllt und ein Hohlraumvolumen an der Oberseite des Glasteils der Titrationsspritze entsteht. Um das Hohlraumvolumen zu entfernen, drehen Sie die Titrationsspritze parallel zum Boden.
Entfernen Sie dann den Kolben und neigen Sie den Glasteil leicht zum Boden. Schütteln Sie die Titrationsspritze vorsichtig, so dass sich die Lösung zum Glasteil der Titrationsspritze bewegt und den größten Teil des Hohlraumvolumens ausfüllt. Stellen Sie aber sicher, dass zwei bis drei Mikroliter Hohlraumvolumen übrig bleiben.
Während Sie die Spritze parallel zum Boden halten, setzen Sie den Kolben wieder ein. Halten Sie dann die Titrationsspritze aufrecht und tauchen Sie die Nadelspitze wieder in die Metalllösung. Als nächstes drücken Sie den Kolben nach unten, bis keine Luft mehr aus der Nadel kommt, und laden Sie die Titrationsspritze, indem Sie den Kolben langsam bis knapp über die 50-Mikroliter-Marke ziehen, während Sie die Nadelspitze in der Lösung halten.
Führen Sie den Glasteil der Titrationsspritze vorsichtig in die Bürette ein und schrauben Sie ihn fest, bis der Finger fest ist. Anschließend absorbieren Sie mit einem leichten empfindlichen Scheibenwischer die Lösung, die aufgrund der Kompression des Kolbens aus der Titrationsspritze kommt, ohne die Nadelspitze zu berühren. Als nächstes führen Sie die Bürette mit einer Titrationsspritze in die Probenzelle ein und befestigen Sie sie sicher.
Um die Parameter der ITC-Software einzustellen, wählen Sie die Gerätesteuerung. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit und die Temperatur ein. Geben Sie dann unter Experimentdetails die Spritzen- und Zellkonzentrationen in Millimolareinheiten ein.
Wählen Sie anschließend im Abschnitt Experimentmethode die Option Inkrementelle Titration aus. Klicken Sie auf Setup und geben Sie 20 Injektionen von 2,5 Mikrolitern an und wenn mehr Auflösung erforderlich ist, um das Bindungsereignis zu beobachten, erhöhen Sie die Anzahl der Injektionen und verringern Sie das Volumen pro Injektion. Geben Sie anschließend den Zeitabstand zwischen jeder Injektion ein, so dass er lang genug ist, damit sich das Signal ausgleicht und zum Ausgangswert zurückkehrt, normalerweise 300 Sekunden.
Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Ausführen, um das Experiment zu starten und anzugeben, wo die Daten gespeichert werden. Die Titration von Cu(II) wurde in C-Peptid durchgeführt, was zeigt, dass die Zugabe von 150 Mikromolar Cu(II) einen sofortigen Anstieg der Bande bei 600 Nanometern verursachte, die der d-d-Bande von Cu(II) zugeschrieben wird, und weiter zunahm, bis 300 Millimolar Cu(II) hinzugefügt wurden. Eine weitere Zugabe über 300 Mikromol Cu(II) erhöhte nicht die Absorption des d-d-Bans, was auf eine Sättigung hinweist und dass Cu(II) an C-Peptid in einem 1:1-Komplex mit einem logarithmischen K-Wert von mehr als sechs bindet.
C-Peptid wurde in etwa 10 Mikromolaren Kupfer-Phen-Komplex titriert und die Absorption aus dem Ladungstransferband bei 265 Nanometern nahm ab, was darauf hindeutet, dass das C-Peptid in der Lage war, Cu(II) aus dem Phenanthrolinliganden mit einem log K-Wert von 7,4 bis 7,8 zu chelatieren. Das ITC-Thermogramm zeigt die Titration von 1,4 Millimolar Cu(II) in 154 mikromolare C-Peptide in 15 Millimolar MOPS-Puffer. Es wurde festgestellt, dass die Bindungsaffinität einen logarithmischen K-Wert von acht mit einer Änderung der Enthalpie von 8 Kilojoule pro Mol aufweist.
Gibbs freie Energie als minus 46 Kilojoule pro Mol und Änderung der Entropie als 120 Joule pro Mol pro Kelvin. Eine kontrollierte Titration von 1,4 Millimolar Cu(II) in 15 Millimolar MOPS-Puffer in Abwesenheit von C-Peptid zeigt keine Bindung im Thermogramm. Ich würde sagen, dass alles sauber ist.
Wenn Metallionen oder Peptide aus früheren Experimenten übrig bleiben, kann dies die Stöchiometrie drastisch beeinflussen und zu einer unbekannten Konkurrenz in den Bindungsexperimenten führen. Der Zirkulardichroismus ist eine weitere Methode zur Untersuchung von Metallpeptid- oder Metallproteinwechselwirkungen, da er die Chiralität betrachtet. Die Massenspektrometrie kann diese Komplexe auch abfragen, indem sie Massenänderungen betrachtet.
Diese Technik wurde von vielen Labors verwendet, die Metallionen untersuchen, die mit Peptiden oder Proteinen interagieren.
