Diese Studie beschreibt die Isolierung der intrapulmonalen Arterie von Ratten und vaskulären glatten Muskelzellen. Mehrere experimentelle Protokolle wurden verwendet, wie z.B. die Verwendung der Organbadtechnik zur Untersuchung der vaskulären Reaktion der intrapulmonalen Arterie. Intrapulmonale Arterien und vaskuläre glatte Muskelzellen sind ausgezeichnete Modelle, um vaskuläre Physiologie und Pathophysiologie zu untersuchen.
Anpassungen dieser Technik könnten die vaskulären Reaktionen von Medikamenten, Extrakten oder sekundären Pflanzenstoffen bewerten. Die Montage des isolierten intrapulmonalen arteriellen Rings in einem Organbad ermöglicht die Verwendung isolierter intrapulmonaler Arterien, um die Rolle eines Arzneimittels bei der Modulation verschiedener Krankheiten, einschließlich pulmonaler Hypertonie, zu bewerten. Die experimentellen Protokolle sind technisch machbar, aber die entscheidenden Schritte sind kompliziert und wesentlich für den Erfolg, so dass eine visuelle Demonstration es einfacher macht, sie zu verstehen und zu verfolgen.
Kittiwoot To-on, ein Masterstudent in Physiologie vom Cardiovascular Research Unit Laboratory, Department of Physiology, Faculty of Medical Science, Naresuan University, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie, indem Sie einen einzelnen Lungenlappen mit einer 11-Zentimeter-Schere schneiden und auf eine neun Zentimeter große Petrischale legen, wobei die mediale Seite oder Lungenwurzel nach oben zeigt. Beobachten und identifizieren Sie die Ausrichtung der Vene, Bronchien und Arterie von oben nach unten.
Schneiden Sie den Bronchus längs mit einer Schere auf. Verwenden Sie dann die 11-Zentimeter-Pinzette, um die Spitze des Bronchus zu greifen. Sezieren und entfernen Sie vorsichtig die Bronchus und Venen aus der Lunge.
Verwenden Sie die Pinzette, um die Spitze der intrapulmonalen Arterie zu greifen und sie vorsichtig mit einer Schere aus dem Lungengewebe zu sezieren. Halten Sie die isolierte intrapulmonale Arterie in kalter Krebslösung, bis die Organbadanordnung eingerichtet ist. Nach der Isolierung der intrapulmonalen Arterie den Hauptast der intrapulmonalen Arterie längs mit der 11-Zentimeter-Schere aufschneiden und in zwei Millimeter große Streifen schneiden.
Tauchen Sie die intrapulmonalen Arterienstreifen in DM, dann inkubieren Sie die Streifen für eine Stunde bei vier Grad Celsius in TM, die ein Milligramm pro Milliliter Papain, 0,04% BSA und 0,4 Millimolar DTT enthalten. Dann bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren. Fügen Sie ein Milligramm pro Milliliter Kollagenase Typ IA in DM hinzu und inkubieren Sie erneut bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.
Das Gewebe in frisches TM überführen und durch sanftes Reiben mit einer Pasteur-Glaspipette dispergieren. Verreiben Sie weiter, bis isolierte glatte Gefäßmuskelzellen in der Badelösung unter dem Mikroskop sichtbar werden. Isolieren Sie die intrapulmonale Arterie, wie zuvor gezeigt, und schneiden Sie den Hauptast der intrapulmonalen Arterie in Ringe von etwa zwei Millimetern Länge.
Befestigen Sie die intrapulmonalen Arterienringe in Organbadkammern, indem Sie sie auf zwei Edelstahldrähte mit einem Durchmesser von 40 Mikrometern auffädeln. Befestigen Sie Edelstahldrähte, die mit intrapulmonalen Arterienringen befestigt sind, an den isometrischen Kraftaufnehmern, die mit dem Datenerfassungsgerät verbunden sind, und an dem Computersystem, das mit der geeigneten physiologischen Software zur Datenerfassung und -analyse installiert ist. Dann erhöhen Sie sanft die Spannung des intrapulmonalen Arterienrings auf ein Gramm.
Lassen Sie die Gefäßsegmente bei einer Ruhespannung von einem Gramm etwa 45 Minuten im Gleichgewicht liegen. Stellen Sie während der Äquilibrierungsphase sicher, dass die Krebslösung regelmäßig alle 15 Minuten gewechselt wird. Testen Sie nach dem Gleichgewicht die Lebensfähigkeit der Gefäße, indem Sie ihre Vasokonstriktion zu einer hohen extrazellulären Kaliumlösung messen.
Beurteilen Sie das Vorhandensein oder Fehlen von Endothel, indem Sie die Relaxationsreaktion auf Acetylcholin in Ringen berechnen, die mit PE vorkontrahiert sind. Entfernen Sie das Endothel mechanisch, indem Sie das Innere des Gefäßes vorsichtig mit einem kleinen Draht reiben, um eine Denudation zu induzieren. Dann gleichen Sie die arteriellen Ringe für 30 Minuten vor Beginn der Testexperimente aus. Untersuchen Sie die entspannende Wirkung des Pflanzenextrakts, indem Sie intrapulmonale Arterienringe mit PE vorkontrahieren. Dann fügen Sie vorsichtig 0,1 bis 1000 Mikrogramm pro Milliliter des Pflanzenextrakts kumulativ zu endothelintakten Ringen und endothelentblößten Ringen hinzu, um Vasorelaxation zu induzieren und eine konzentrationsabhängige Reaktionskurve zu erhalten.
Stellen Sie sicher, dass das wirksame DMSO, das als Lösungsmittel verwendet wird, ebenfalls ähnlich bewertet wird, um als Negativkontrolle zu dienen. Bewerten Sie den vasorelaxierenden Wirkmechanismus des Pflanzenextrakts, wie im Textmanuskript erwähnt. Dann, nachdem sich die Kontraktionen zu PE stabilisieren, fügen Sie kumulative Konzentrationen des Pflanzenextrakts hinzu.
Präsentieren Sie die Wirkungen von Pflanzenextrakt als prozentuale Entspannung der intrapulmonalen Arterienringe in Gegenwart von Inhibitoren im Vergleich zur Reaktion der intrapulmonalen Arterienringe ohne Inhibitoren und konstruieren Sie die Konzentrationsreaktionskurve. In einer intakten intrapulmonalen Arterie des Endothels löste der Pflanzenextrakt eine konzentrationsabhängige Reaktion der Vasorelaxation aus. Die Eradikation des Endothels reduzierte die durch den Pflanzenextrakt induzierte Vasorelaxation erheblich, was sich in der Erhöhung des EC50 um das 2,2-fache widerspiegelt, die Hemmung von eNOS und EDHF verringerte offensichtlich die vasorelaxierende Reaktion auf den Pflanzenextrakt.
Dadurch verschob sich die Konzentrationsreaktionskurve nach rechts und erhöhte den EC50, ohne die Emax-Werte zu verändern. Im Gegenteil, Indomethacin zeigte keine Wirkung auf die vasorelaxierende Reaktion auf den Pflanzenextrakt. In den endothelentblößten intrapulmonalen Arterienringen verringerten Kalzium-aktivierte Kaliumkanalblocker die vasorelaxierende Reaktion auf den Pflanzenextrakt.
Während Blocker von spannungsabhängigen oder ATP-empfindlichen Kaliumkanälen keine Abweichung zeigten. Die Vorinkubation mit dem Pflanzenextrakt hemmte die Calciumchlorid-induzierte Kontraktion. Die endothelentblößten intrapulmonalen Arterienringe, die mit kalziumfreier Krebslösung und PE vorinkubiert wurden, führten zu einer vorübergehenden Kontraktion.
Im Vergleich zum Vehikel reduzierten die Pflanzenextrakte die durch PE induzierte Kontraktion signifikant. Während des Eingriffs muss man Vene, Bronchien und Arterie frühzeitig eindeutig identifizieren. Das Schneiden oder Beschädigen der Arterie reduziert ihre Länge und beeinflusst die vaskulären Reaktionen. Diese Technik kann angepasst werden, um Verbindungen zu untersuchen, die als Prototypen für die Behandlung von pulmonalen vaskulären Erkrankungen wie pulmonaler arterieller Hypertonie dienen könnten.
