Name: isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells
Uploaded: 2016-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01HL056046 auf PAL und K99HL116769 zu AJT) und das Forschungsinstitut bei Nationwide Kinderkrankenhaus (PAL und AJT).

Ethik-Erklärung: Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien durchgeführt, und es wurde von der Institution Animal Care und Use Committee bei Nationwide Kinderkrankenhaus zugelassen. 1. Vorbereitung / Einstellungen Anmerkung: Diese Isolationstechnik erfordert zwei Langendorff Heizschlangen Seite an Seite angeordnet auf einem Ringständer, und parallel zu einem zirkulierenden Wasserbad verbunden. <ol><li> Schalten Sie Wasserbad zirkuliert und die Temperatur anpassen eine endgültige Temperatur von 33-34 ° C an der Spitze der Langendorff-Kanüle (das Wasserbad verwendet in diesem Satz zu erreichen up wird auf 40 ° C aufgrund einer 6-7 ° C Verlust in Temperatur über Schläuche). Schalten Sie die Perfusion Pumpen und setzen Perfusionsrate bis 0,5 ml / min. <ol><li> Reinigen sowohl der Wassermantel Heizschlangen angebracht Schläuche und 25 Gauge Kanüle durch jeweils mit 50 ml 70% Ethanol, gefolgt von 100 ml des autoklavierten Reinstwasser Spülung. </li><li> Deaktivieren Sie die HeizschlangenLuft mit einer Spritze und wasche mit 10 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Phenolrot durch Drücken. Lassen Sie HBSS in den Heizschlangen und Schläuche. </li><li> Bringen Sie eine sterile 10 ml Luer-Lock-Spritze mit Raumtemperatur HBSS ohne Phenol gefüllt rot auf den Schlauch. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in den Schlauch und Heizschlangen eingefangen werden, wenn die HBSS Spritze angebracht, da diese Luftembolien während der Verdauung die dazu führen könnten sich negativ auf die VSMC Isolation auswirken. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die 25-Gauge-Kanüle von den Heizschlangen und auf einem anderen sterilen 10-ml-Spritze gefüllt mit eiskaltem HBSS ohne Phenolrot. Halten Sie diese auf Eis bis zum Gebrauch. Wiederholen Sie dies für die anderen Kanüle. </li><li> Bereiten Enzymaufschlußlösung. <ol><li> Wiegen Kollagenase Typ 2 nach bestimmten Chargennummer für 75 ml Aufschlußlösung auf eine Endkonzentration von 300 Units / ml zu erreichen. </li><li> Auflösen Kollagenase in 75 ml HBSS mit Phenolrot. Als Nächstes fügen Sie 1,5 ml 00,1 mg / ml Sojabohnen - Trypsin - Inhibitor und 75 ul 1 M CaCl 2 zur Mischung. </li></ol></li><li> Bei der Verwendung von sofort die Aufschlußlösung, erwärmen sie auf 37 ° C. Wenn nicht, legen Sie sie bei 4 ° C für bis zu 6 Stunden. Diese Lösung muss täglich frisch hergestellt werden. </li><li> Bereiten Sie die Stop-Lösung / Plattenmedien. <ol><li> Je 100 ml hitzeinaktiviertem FBS, 5 ml L-Glutamin, 5 ml der nicht-essentielle Aminosäuren, 5 ml HEPES, und 1 ml primocin zu 500 ml hohen Glucose (4,5 g / l) DMEM. Filtersterilisation wird empfohlen. </li><li> Aliquot 6 ml der Stopplösung in jede von zwölf 15 ml konische Röhrchen, nummeriert A1-A6 und B1-B6, und bei 4 ° C. Aliquot 50 ml Stopplösung in einem 50 ml konischen und in 37 ° C-Inkubator. Anmerkung: Dieser Schritt kann auch den Tag hergestellt werden, vor der Isolierung, falls erforderlich. Diese Stop-Lösung wird als die Plattierung Medien nach Zellisolierung verwendet werden. </li></ol></li><li> Bereiten Sie zwei 1 ml Spritzen mit einer 30 G-Nadel ausgestattetmit 100 &amp; mgr; l Heparin (1000 Einheiten / ml). </li><li> Schneiden Sie ein 5 cm großes Stück 5-0 chirurgische Seide. Binden Sie eine lose Überhandknoten in der OP-Seide mit einem Ende doppelt so lang ist wie die andere. Setzen Sie auf die 25-Gauge-Kanüle, aber nicht zu fest anziehen. Wiederholen Sie dies für die anderen 25 G Kanüle. </li><li> Füllen Sie vier 35 mm sterile Petrischalen (# 1-4) mit 2 ml sterilem, eiskaltem, HBSS ohne Phenolrot. Halten Sie sich auf dem Eis. </li></ol> 2. Euthanasie, Herz Isolation und Kanülierung <ol><li> Vor Herz Isolierung zu gewährleisten, dass die Aufschlusslösung und 50 ml konischen Stopplösung warm sind. Entfernen Sie die HBSS Spritze mit aufgesetzter 25 G Kanüle aus dem Eis und in eine Bürettenklemme (oder Ring Stativklemme) an einem Ringständer. </li><li> Anesthetize Mäuse unter Verwendung von 3% Isofluran. Bestätigen Sie die Maus durch eine Zehe Berührung auf jedem Hinterbein betäubt. Wenn die Beinzuckungen, wird die Maus noch nicht betäubt, so 1 min warten und die Zehen berühren wiederholen. </li><li> Setzen Sie die Halsvene durch das Fell ein Entfernennd Haut auf der anterioren des Halses mit einer Schere. Als nächstes benutzen Pinzette vorsichtig rund um die Halsvene jedes Fett zu entfernen. Nach dem Entfernen von Fett, injizieren langsam 100 &amp; mgr; l Heparin (1000 Einheiten / ml). Legen Sie einen chirurgischen Schwamm über die Vene starke Blutungen zu vermeiden. </li><li> Nach 1 min, um offene Brust Herz, Lift Herz mit einer gebogenen Pinzette belichten und auszuschneiden es einer Schere, um sicherzustellen, intakt durch die erste brachiocephalic Zweig die aufsteigende Aorta zu halten. Unmittelbar danach ist Herz in einer 35-mm-Schale (# 1) mit eiskaltem HBSS ohne Phenolrot und spülen. Hinweis: Führen Sie die folgenden vier Schritte mit einem Binokular. </li><li> Positionieren Sie die 25 G Kanüle, die in einem Winkel von 45 ° stehen auf dem Ring angebracht ist, so dass die Spitze knapp unter der Oberfläche eiskaltem HBSS in Schale # 2 befindet und ist deutlich sichtbar durch das Binokular. Übertragen Sie das Herz auf Teller # 2. </li><li> Mit Dumont Pinzetten, setzen die Aorta durch sanft überschüssige Fettgewebe über stumpfe Dissektion p Entfernenrevent Punktierung oder Einreißen der Aorta. Als nächstes verwenden Zange die Aorta über die 25 G Kanüle zu gleiten. </li><li> Führen Sie die Kanüle nach unten durch die Aorta, in der Nähe, aber nicht über die Aortenklappe, die die Integrität des Ventils beeinträchtigen wird und deshalb die Retroperfusion. Sobald die Kanüle an Ort und Stelle ist, schieben Sie den vorgebunden Seide über die Aorta, und festziehen. Binden Sie einen zweiten Knoten um die Aorta einen quadratischen Knoten zu bilden, das Herz zu sichern. </li><li> Sobald die Aorta fest gebunden ist, spülen Sie vorsichtig das restliche Blut aus dem Herz-Kreislauf mit dem eiskalten HBSS in der Spritze mit der Kanüle 25 G angebracht. Achten Sie darauf, zu viel, um nicht drücken, um übermäßige koronarer Druck zu vermeiden. Nur eine sehr langsame und sanfte Spülung erforderlich ist, die bündig abzuschließen. Leckagefreie Aorten-Kanülierung kann auch während dieser sanften bündig zu beachten. </li><li> Schalten Sie die Perfusionspumpe den Fluss von HBSS zu beginnen. Entfernen Sie die 25 G Kanüle (mit dem Herzen angebracht) von der HBSS Spritze, die Pflege zuhalten Sie die Kanüle Nabe mit HBSS gefüllt, und schließen Sie es an den warmen HBSS gefüllten Heizschlangen. Beginnen Perfusion des Herzens mit der Transfusionspumpe mit einer Rate von 0,5 ml / min für 8 min. </li><li> Nachdem das erste Herz einer Kanüle versehen ist und auf dem System durchblutet wird, wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,8 für das zweite Herz. Diese Isolationen für jedes Herz versetzt sein, damit eine sorgfältige Planung und Timing erforderlich sind. </li></ol> 3. Verdauung <ol><li> Nachdem sie mit HBSS gespült, die Spritze 10 ml HBSS derzeit eine auf der Pumpe mit 10 ml vorgewärmten Aufschlußlösung gefüllt verändern. Perfundieren jedes Herz mit Aufschlußlösung für 12 min bei einer Geschwindigkeit von 0,5 ml / min. Sammeln Sie keine Fraktionen, die aus diesem ersten Aufschluss ergeben, da dies jeden Rest Blut und Endothelzellen enthalten wird. </li><li> Nach 12 min, ml / min, legen Sie eine 15 ml konischen (Rohr A1 oder B1, für jede Verdauung mit dem ersten oder zweiten Herz entspricht), um die Perfusion Rate mit kaltem Stopp solut gefüllt bis 0,4 ändernIon in einem Eiskübel unterhalb des Herzens, um VSMC angereicherte Perfusat Sammlung zu beginnen. </li><li> Nach 15 min, die konische für 10 Minuten unmittelbar nach der Entnahme aus beiden Fraktionen bei 89 xg bis Rohr A2 oder B2 und Schleuder konischen Rohr A1 und B1 Sammlung ändern. Wenn die Spritze mit der Aufschlußlösung auf die Pumpe gefüllt weniger als 1 ml Lösung, zu ersetzen mit einer frisch gefüllten 10-ml-Spritze der Aufschlußlösung. </li><li> Nach der Zentrifugation absaugen Überstand aus jeder Sammelröhrchen, so dass etwa 0,5 ml. Pellet aus A1 mit 2 ml warmem Stop-Lösung (oder Plattierung Medien). In Aufwirbelung von A1 Rohr B1 Rohr und das Röhrchen in 37 ° C-Inkubator mit der Kappe lose. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.3 und 3.4 bis alle Rohre (bis A6 und B6) für eine Gesamtsammelzeit von 90 min verwendet. Bei 80 min der Verdauung, schneiden Sie die Herzspitze öffnen, um alle Zellen auszuspülen, die innerhalb der Kammer gefangen werden können und sammeln diese Zellen in Rohr A6 und B6, welche nach Süctively. Hinweis: Gelegentlich wird das Herz fallen die Kanüle vor dem 90 Minuten-Zeitpunkt ab. Wenn dies der Fall ist, rufen Sie das Herz und die Stelle in eine sterile 35 mm Petrischale gefüllt mit 2 ml Aufschlußlösung. Schneiden Sie die Spitze des Herzens und sanft das Herz mit Aufschlußlösung spülen. Als nächstes filtern die 2 ml Aufschlusslösung durch eine sterile 100 &amp; mgr; m Zelle Sieb in einem 50 ml konischen und in den Schlauch A6 oder B6. </li><li> Nach jeder Drehung der anschließenden Rohre (A2 und B2), die resuspendierten VSMCs zum vorherigen Sammelröhrchen (kombiniert A1 und B1) hinzuzufügen. Auch darauf achten, nicht die Aufschlusslösung in die Pumpe laufen zu lassen und schalten Sie die 10-ml-Spritzen nach Bedarf in der gesamten Verdauung. </li><li> Nachdem alle Rohre kombiniert werden, Zentrifuge die VSMC reiche Suspension bei 89 × g für 10 min. </li><li> Aspirieren wie viel Überstand von Sammelröhrchen wie möglich. Resuspendieren verbleibende Pellet in 2 ml Medium und die Platte auf einer 35-mm-Kulturschale Plattieren. Platz Kulturschale in 37 ° C Inkubator für 24 Stunden. </li></ol> 4. Zellkultur Hinweis: Führen Sie die verbleibenden Schritte in der Biosicherheitsschrank. <ol><li> Nach 24 Stunden absaugen sanft die Plattenmedien. Die Kultur wird normalerweise eine große Menge an Schmutz. Um die Zellen zu waschen, fügen Sie 2 ml warmem, sterilem PBS und sanft das Gericht gegen zwei Fingern tippen, während im Uhrzeigersinn dreht. </li><li> Nach dem Drehen um 360 °, die PBS absaugen und ein zweites Mal wiederholen. weitere 2 ml steriler, warm PBS absaugen PBS und hinzufügen. Überprüfen Sie die Kulturschale unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, gibt es wenig auf der Platte kein Schmutz ist. Zellkonfluenz kann ebenfalls zu diesem Zeitpunkt bestimmt werden. </li><li> Wenn Schmutz in der Kulturschale bleibt, wiederholen Sie Schritt 4.2. Wenn die Kulturschale frei von Schmutz ist, die PBS absaugen und 2 ml warmem Plattierung Medien hinzufügen. </li><li> Nach 24 Stunden wieder waschen Sie die Zellen mit warmem, sterilem PBS jede endgültige Schutt oder toten Zellen aus der Kultur zu entfernen. Saugen Sie das PBS und pschnüren weitere 2 ml warmem Plattenmedien auf den Zellen. </li><li> Schauen Sie auf den täglich Zellen und ernähren sich alle 48 Stunden mit frisch aufgewärmt Plattierung Medien. An diesem Punkt können die Zellen für Standard-Zellkultur-Assays verwendet werden. VSMCs sollte ca. 80% konfluent 4-5 Tage nach der Plattierung, obwohl bis zu 7 Tage dauern kann, bis das Verfahren perfektioniert. Wenn Splitting auf nachfolgende Passagen, maximal 1 verwenden: 4 35 mm-Schalen (oder einem vergleichbaren Bereich der Kulturschalen). </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Der Zweck dieser Studie war es bestehende Zellisolierung Protokolle anzupassen, die Ausbeute an koronaren glatten Gefäß von murinen Herzen zu erhöhen. Die meisten der Pionierarbeit in der Biologie der glatten Gefäßmuskulatur wurde mit kultivierten Rattenaorta glatten Muskelzellen durchgeführt. Diese Studien grundlegende Kenntnisse der molekularen Mechanismen zur Verfügung gestellt , die VSMC Wachstum steuern, Migration und Hypertrophie 7. Da jedoch das Feld fortschritt, wurde es offensichtlich, daß VS...

Das Ziel dieser Methode ist, vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) von der murine Koronarzirkulation für die Verwendung in der Zellkultur und Standard-Zellkultur-Assays zu isolieren. Wir entwickelten diese Technik, die molekularen Mechanismen des vaskulären Remodelling bei Diabetes zu beurteilen. Wir haben früher nach innen hypertrophen Umbau in den septalen koronarer Arteriolen in der db / db - Maus - Modell von Diabetes 1 berichtet. Aufgrund der begrenzten Menge an in den murinen septalen Koronararterien, experimentellen Standardtechniken gefunden Körpergeweben Protein Veränderungen (zB Western - Blot) in db / db Mäusen und Kontrollmäusen sind bestenfalls schwierig. Darüber hinaus haben wir bereits gezeigt , dass der Angiotensin - Rezeptor - Blocker (ARB) Losartan den Umbau in db / db - Mäusen beobachtet 2 reduziert. Daher Isolierung von primären VSMCs aus dem Herz-Kreislauf ermöglicht es uns, weitere Veränderungen im Phänotyp VSMC untersuchen oder aktivierten Signalwege in diabetischen Mäusen, die Beiträgen sein kannting widriger koronaren Arteriolen Umbau. Zahlreiche Studien haben canonical Signalwege VSMCs isoliert aus Nagetier Aorta, anstatt in jedem spezifischen Gefäßbett unter Verwendung erläutert. Wir haben jedoch Gefäßbett spezifischen Umbau in Koronar-, Aorten gezeigt, und mesenterialen Zirkulationen von db / db - Mäusen 1, die VSMCs in jedem Gefäßbett was darauf hindeutet , kann unterschiedlich sein. Daher ist es notwendig, VSMCs von jedem Gefäßbett zu isolieren, um besser auf die pathologischen Veränderungen verstehen in jedem Satz von VSMCs auftreten. Es gibt eine Vielzahl von verschiedenen Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Aorten-VSMCs. Jedoch Derzeit gibt es nur eine Studie , die auf die Isolierung von VSMCs von der Maus Koronarzirkulation 3 veröffentlicht wurde. Teng et al. war der Erste, der ein Verfahren zur Isolierung von VSMCs von der Maus Koronarkreislaufs Bericht zu erstatten; jedoch haben wir das Protokoll erheblich geändert, da sie auch endothelial cel isoliertls. Andere Labors habe auch das Protokoll von Teng et al. Koronaren Arterienmuskelzellen und glatten Atemwegsmuskelzellen 4,5 zu isolieren. Die Veränderungen, wir aufgenommen haben, wird eine Population von Zellen ergeben hoch für VSMCs aus dem Herz-Kreislauf angereichert. Die retrograden Perfusion des isolierten Säugetierherzens oder Langendorff - Technik wurde 1897 von 6 Oscar Langendorff etabliert und wird noch heute weit verbreitet für die Isolierung von Herz - Kreislauf - Zellen verwendet. Die Technik, die hier präsentiert, gepaart mit dem Fortschritt der modernen murinen genetischen Veränderungen, stellt ein wertvolles Instrument zur näheren Untersuchung des molekularen Verhalten von VSMCs aus dem Herz-Kreislauf.

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solution</td><td>Fisher</td><td>MT-25-060</td><td></td></tr><tr><td>Primocin - 20 ml</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 10 mM 100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut 200 mM - Gibco</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Cell Strainer 100 &amp;micro;m nylon mesh</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm</td><td>Fisher</td><td>12-565-91</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Apparatus black silk suture 5-0</td><td>Fisher</td><td>14-516-124</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type-2&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red)</td><td>Life Technologies</td><td>14170-161</td><td></td></tr><tr><td>5.0 ml heating coil with degassing bubble trap</td><td>Radnoti</td><td>158830</td><td></td></tr><tr><td>11 plus pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>Circulating heated water pump</td><td></td><td></td><td>any brand will work</td></tr></tbody></table>

isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells

Während die Isolierung und Kultivierung von glatten Gefäßmuskelzellen (VSMCs) aus großen Gefäßen gut etabliert ist, haben wir versucht und Kultur VSMCs aus dem Herz-Kreislauf zu isolieren. Herzen mit intakten Aortenbogen wurden über retrograden Langendorff mit Verdauungslösung , enthaltend 300 Einheiten / ml Kollagenase Typ II, entfernt und perfundiert 0,1 mg / ml Sojabohnen - Trypsin - Inhibitor und 1 M CaCl 2. Die perfusates wurden 90 min bei 15 Minuten-Intervallen gesammelt, durch Zentrifugation pelletiert, in plating Medien resuspendiert und auf Gewebekulturschalen plattiert. VSMCs wurden durch die Anwesenheit von SM22α, α-SMA und Vimentin gekennzeichnet. Einer der Hauptvorteile dieser Technik der Verwendung ist die Fähigkeit VSMCs aus dem koronaren Kreislauf von Mäusen zu isolieren. Obwohl die geringe Anzahl von Zellen, für die die Zellen können isoliert koronaren VSMCs werden werden in einer Vielzahl von gut etablierten Zellkulturtechniken und ASSA erhalten können einige Anwendungen begrenzen verwendet, verwendetys. Studien VSMCs aus genetisch veränderten Mäuse können weitere Informationen über Struktur-Funktions-und Signalprozesse, verbunden mit vaskulären Erkrankungen bieten zu untersuchen.

Aufgrund der neuartigen Aspekt unserer koronaren VSMC Isolationstechnik haben wir versucht, um die Reinheit der Zellisolierung zu bestimmen. Maus identifiziert koronaren VSMCs auf der Grundlage ihrer Morphologie und Immunofluoreszenz-Färbung bis zu Passage 2. Aufgrund der Morphologie der Zellen in der Kultur nach der ersten Wäsche, die Isolationsprozedur entfernt effektiv Kardiomyozyten und Endothelzellen. Die VSMCs behalten ihre Morphologie bis Kanal 2 (Figur 1). Es b...

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Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Isolierung und Kulturtechniken von murinen primären vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) aus dem koronaren Kreislauf zu demonstrieren. Sobald VSMCs isoliert wurden, können sie für viele Standardkulturtechniken verwendet werden.

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

isolation-of-murine-coronary-vascular-smooth-muscle-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Aufrufe.  The Ohio State University College of Medicine.  Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Isolierung und Kulturtechniken von murinen primären vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) aus dem koronaren Kreislauf zu demonstrieren. Sobald VSMCs isoliert wurden, können sie für viele Standardkulturtechniken verwendet werden. 

Serie: Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Isolierung und Exzision Murine Aorta; Eine vielseitige Technik in das Studium der Herz-Kreislauf-Krankheit

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

Forschung

Medizin

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

Isolierung humaner Nabelschnur arteriellen glatten Muskelzellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Biologie

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Neurowissenschaften

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Isolation der Lungenarterie glatten Muskelzellen aus neugeborenen Mäusen

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Isolierung und Reinigung von murinen Herzperizyten

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of vasoconstriction and vasorelaxation. After isolating the IPA and VSMCs, the characteristics of vascular responses in physiological and pathological conditions can be assessed in the absence of extrinsic factors such as nerve signals, hormones, cytokines, etc. Thus, the IPA and VSMCs serve as excellent models for studying vascular physiology/pathophysiology, along with various experimental investigations, such as modulation by pharmacological agents, patch-clamp electrophysiological analysis, calcium imaging, etc. Here, we have used a technique for isolating the IPA to investigate vascular responses in an organ bath setup. IPA segments were mounted on the organ bath chamber via intraluminal wires and stimulated by various pharmacological agents. The changes in IPA vascular tone (i.e., vasoconstriction and vasorelaxation), were recorded using an isometric force transducer and physiological data analysis software program. We implemented several experimental protocols, which can be adapted to investigate the mechanisms of vasorelaxation/vasoconstriction for studying the pharmacological activities of phytochemical or synthetic drugs. The protocols can also be used to evaluate drugs&#39; roles in modulating various diseases, including pulmonary arterial hypertension. The IPA model allows us to investigate the concentration-response curve, which is crucial in assessing drugs&#39; pharmacodynamic parameters.

Vascular responses of arterial pulmonary circulation can be explored using intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs). The present study describes the isolation of IPA in detail and the protocols used for investigating vasorelaxation in response to physiological stimuli.

Isolierung von intrapulmonalen Arterien- und glatten Muskelzellen zur Untersuchung von Gefäßreaktionen

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Isolierung und magnetische Trennung von murinen CD34+ -Stammzellen aus der Gefäßwand

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury and repair. Establishing a stable and efficient method to culture functional murine CD34+ VW-SCs is essential for further investigating the mechanisms involved in the proliferation, migration, and differentiation of these cells under various physiological and pathological conditions. The described method combines magnetic bead screening and flow cytometry to purify primary cultured resident CD34+ VW-SCs. The purified cells are then functionally identified through immunofluorescence staining and Ca2+ imaging. Briefly, vascular cells from the adventitia of the murine aorta and mesenteric artery are obtained through tissue block attachment, followed by subculturing until reaching a cell count of at least 1 &#215; 107. Subsequently, CD34+ VW-SCs are purified using magnetic bead sorting and flow cytometry. Identification of CD34+ VW-SCs involves cellular immunofluorescence staining, while functional multipotency is determined by exposing cells to a specific culture medium for oriented differentiation. Moreover, functional internal Ca2+ release and external Ca2+ entry is assessed using a commercially available imaging workstation in Fura-2/AM-loaded cells exposed to ATP, caffeine, or thapsigargin (TG). This method offers a stable and efficient technique for isolating, culturing, and identifying vascular wall-resident CD34+ stem cells, providing an opportunity for in vitro studies on the regulatory mechanisms of VW-SCs and the screening of targeted drugs.

Autor im Rampenlicht: Verbesserte Isolierung und Charakterisierung von in der Gefäßwand ansässigen murinen CD34+ -Stammzellen mittels magnetischer Bead-Screening-gekoppelter Durchflusszytom

This study has established a stable and efficient method for the isolation, culture, and functional determination of vascular wall-resident CD34+ stem cells (CD34+ VW-SCs). This easy-to-follow and time-effective isolation method can be utilized by other investigators to study the potential mechanisms involved in cardiovascular diseases.

Immunmagnetische Isolierung von in der Gefäßwand ansässigen CD34+ -Stammzellen aus Mäusen

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...