Dieses Protokoll beschreibt das erste apikale In-a-Dish-Modell und stellt eine entscheidende Verbesserung gegenüber basalen lateralen enteroiden In-a-Dish-Modellen dar, wenn eine In-vitro-Modellierung potenzieller Therapeutika für die orale Verabreichung erstellt wird. Diese Methode ermöglicht den Zugang zur apikalen Oberfläche von Enteroiden. Verbindungen können zu Zellmedien hinzugefügt werden und die Verbindungen werden apikal aufgenommen, wie sie es in vivo wären.
Forscher, die daran interessiert sind, ein In-vitro-System der Darmentzündung zu etablieren, um potenzielle orale Therapeutika zu testen, können diese Technik besonders nützlich finden. Gewebe aus verschiedenen Altersgruppen und Arten kann eine weitere Standardisierung erfordern. Daher können Patienten bei der Festlegung von Polaritätsumkehrzeiten erforderlich sein.
Um die Polarität von 3D-Enteroiden umzukehren, saugen sie Medien aus jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte etablierter basolateraler 3D-Enteroide ab. Fügen Sie 500 Mikroliter fünf Millimolar eiskalt, EDTA oder PBS in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu und brechen Sie den Basalmembranextrakt oder die extrazelluläre Matrixkuppel sanft mechanisch auf, indem Sie fünf- bis sechsmal mit einer P 200-Pipette auf und ab pipettieren. Den Inhalt von vier Bohrlöchern in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen.
Dann fügen Sie acht Milliliter eiskaltes EDTA-Slash PBS in die Röhre hinzu. Übertragen Sie die restlichen 20 Bohrlöcher auf die gleiche Weise. Inkubieren Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius für eine Stunde auf einer rotierenden Plattform oder einem Shaker bei 330 U/min.
Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen und verwerfen Sie den Überstand aus jedem Röhrchen. Kombinieren und waschen Sie die Pellets mit fünf Milliliter DMEM F12. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie 12 Milliliter antibiotikafreies Medium in das Röhrchen geben, um sicherzustellen, dass die Zellpellets resuspendiert werden.
Pippet 500 Mikroliter der enteroiden Suspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei bis fünf Tage oder bis die Enteroide die Polarität umgekehrt haben. Am ersten Tag der Abstinenz wird der Inhalt von vier Vertiefungen einer 24-Well-Platte in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Wiederholen Sie dies für alle gewünschten Vertiefungen bei jeder Behandlung in einem separaten Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen und resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikrolitern von 4% aus Aldehyd-Fixiermittel bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten die Pellets mit 500 Mikrolitern PBS waschen.
Fügen Sie 500 Mikroliter 0,1% Triton X 100 zu den Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen für eine Stunde bei Raumtemperatur. Als nächstes legen Sie die Röhrchen auf einen Rotator oder Shaker bei 200 U/min für 15 Minuten bei zwei bis acht Grad Celsius.
Nach der letzten Inkubation 500 Mikroliter 10% NDS in PBS T hinzufügen und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation eine primäre Antikörperlösung vor. Am nächsten Tag werden je nach Größe des Pellets 250 bis 500 Mikroliter PBS T in die Röhrchen gegeben und bei 200 U/min für eine Stunde bei zwei bis acht Grad Celsius auf den Rotator oder Shaker gelegt.
Fügen Sie 200 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen bei zwei bis acht Grad Celsius im Dunkeln. Am nächsten Tag montieren Sie gefärbte apikale Enteroide, indem Sie die Röhrchen drehen und 100 Mikroliter Überstand entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in den verbleibenden 100 Mikrolitern Überstand und übertragen Sie die Zellsuspension in 500 Mikroliter Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Röhrchen in einer Minizentrifuge für 20 Sekunden. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikroliter Raumtemperatur weit roter Nukleinsäurefärbung. Nach 20 Minuten Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern PBS.
Nach dem zweiten Waschen und Zentrifugieren 70 Mikroliter des Überstands entfernen und die Pellets im verbleibenden PBS-Volumen resuspendieren. Anschließend wird die Zellsuspension auf einen beschrifteten 24 x 60 Millimeter großen Abdeckstreifen überführt. Tragen Sie 75 Mikroliter Mountant direkt auf die Probe auf und entfernen Sie Blasen mit einer Pipettenspitze.
Nach dem Aushärten über Nacht im Dunkeln eine dünne Schicht Glycerin auf die Deckgläser auftragen, dann die Deckgläser auf den Glasobjektträger montieren und vorsichtig an Ort und Stelle drücken. Tippen Sie, um alle Blasen zwischen dem Abdeckschein und dem Schieber zu entfernen. Lassen Sie den Deckschein zwei Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln aushärten, bevor Sie die Enteroide mit 20-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskop abbilden.
Für enteroide Behandlungen etablieren Sie eine apikale nekrotisierende Enterokolitis in einem Schalenmodell für 24 Stunden, wie im Textmanuskript beschrieben. Entfernen Sie vor der Durchführung des Tests 100 Mikroliter Medien aus jeder Vertiefung, wobei die restlichen 400 Mikroliter übrig bleiben. Fügen Sie 400 Mikroliter Zelllebensfähigkeits-Assay-Reagenz zu jeder Vertiefung hinzu.
Mischen Sie den Inhalt auf einem Plattenschüttler fünf Minuten lang bei 200 U/min, um die Zelllyse zu induzieren. Als nächstes übertragen Sie 200 Mikroliter in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Clear-Bodenplatte. Wiederholen Sie dies für die restlichen 600 Mikroliter, wodurch vier technische Replikate pro Bohrloch entstehen.
Mit einem lumineszenzfähigen Plattenleser können Sie Werte bei einer Integration von 0,25 Millisekunden aufzeichnen und die relativen Werte zwischen den Behandlungen vergleichen. Die repräsentative Immunfluoreszenzfärbung der Kontrolle bestätigte die apikale Lokalisation der Kerne in Richtung Lumen und die Detektion von Bösewichten am äußeren Rand des Epithels. Im Vergleich zur Kontrolle induzierte die Exposition gegenüber Lipopolysaccharid, Tumornekrose alpha oder Hypoxie allein keine offensichtlichen Veränderungen in der grobzelligen Morphologie E-Cadherin oder Bösewichtlokalisierung oder Fluoreszenzintensität.
Die Behandlung mit Lipopolysaccharid oder Tumornekrose alpha in Kombination mit Hypoxie störte die Epithelarchitektur und zeigte einen signifikanten Verlust der Adhärenzverbindung und der Bürstengrenzproteinexpression, der durch den Verlust des ECA-Gehörs und die Färbung des Bösewichts nachgewiesen wurde. Die Lebensfähigkeit apikaler Zellen wurde unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen bestimmt. Unter normoxischen Bedingungen im Vergleich zum Kontrolllipo beeinflusste Polysaccharid oder Tumornekrose alpha die Zelllebensfähigkeit von Enteroiden nicht signifikant.
Es wurden jedoch signifikante Abnahmen der Lebensfähigkeit bei Lipopolysaccharid oder Tumornekrose alpha in Kombination mit Hypoxie im Vergleich zu Hypoxie allein beobachtet. Bei der Etablierung eines apikalen In-a-Dish-Modells. Denken Sie daran, EDTA in der Zellsuspension eiskalt zu halten.
Dies verbessert die Polaritätsumkehr und stellt sicher, dass die gesamte ECM ordnungsgemäß verflüssigt und entfernt wird. Andere nachgeschaltete Anwendungen wie QPCR, RNA-seq, Western Blotting oder funktionelle Bewertungen der Barrierepermeabilität können weiter durchgeführt werden, um die Reaktion auf entzündliche Signale bei Hypoxie zu charakterisieren.
