Die dual-funktionelle Titan-immobilisierte Metallaffinitätschromatographie-Strategie kann sowohl N-Glykopeptide als auch Phosphopeptide im selben Workflow anreichern und die biomolekularen Informationen aus derselben Analyse erhöhen. Der Hauptvorteil dieser Anreicherung sind zwei Trennmechanismen, die die gleichzeitige Trennung von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden in getrennten Fraktionen für die nachgeschaltete Massenspektrometrieanalyse ermöglichen. Die Verwendung dieser Anreicherungsmethode kann den Nachweis von Glykosylierung und Phosphorylierung in komplexen biologischen Proben wie Bauchspeicheldrüsengewebe für die Entdeckung von Krankheitsbiomarkern wie Diabetes und Krebs verbessern.
Da diese Methode auf Spinspitzen und Zentrifugation beruht, ist es wichtig, die Zentrifugationsgeschwindigkeit zu kontrollieren und sicherzustellen, dass die Proben frei von Partikeln sind, um Verstopfungen zu vermeiden. Um zu beginnen, kühlen Sie die Teile des Gewebepulverisierers, die mit dem Pankreasgewebe in Kontakt kommen, nämlich die Kammer, der Pulverisierer und der Erholungslöffel, zusammen mit allen Spateln, in einem Styroporbehälter vor. Als nächstes geben Sie Gewebestücke in den vorgekühlten Probenhalter und fügen dem Gewebe einen flüssigen Stickstoff hinzu, bis sie gefroren sind.
Nachdem Sie den Pulverisierer in die Kammer gelegt haben, schlagen Sie ihn fünf- bis zehnmal mit einem Hammer, um die Probe zu zerkleinern, entfernen Sie dann den Pulverisierer aus der Kammer und kratzen Sie anhaftendes Gewebepulver und Stücke ab. Als nächstes fügen Sie einen Löffel flüssigen Stickstoff in die Kammer hinzu, wenn das Gewebe zu schmelzen beginnt, und wiederholen Sie den Pulverisierungsprozess, bis ein feines Pulver erhalten ist, und portionieren Sie die Proben in etwa 100-Milligramm-Aliquots in vorgekühlte Röhrchen. Nach der Herstellung des Lysepuffers lösen Sie je eine Tablette Protease- und Phosphataseinhibitor in 500 Mikrolitern Wasser auf, um einen Vorrat von 20 Mal der gewünschten Endkonzentration zu erhalten, und fügen Sie dem Lysepuffer das erforderliche Volumen jedes Inhibitors hinzu, um die endgültigen Inhibitorkonzentrationen zu erreichen.
Nach Zugabe von 600 Mikrolitern Lysepuffer in das Röhrchen bei 95 Grad Celsius im Heizblock 10 Minuten lang mit Schütteln bei 800 U/min inkubieren, dann die Proben aus dem Heizblock nehmen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Als nächstes beschallen Sie die Proben mit 60-Watt-Energie für 45 Sekunden, verwenden Sie 15-Sekunden-Impulse mit einer 30-Sekunden-Pause dazwischen, und pelletieren Sie die Proben bei 3000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Fügen Sie den Überstand dem Fünffachen seines Volumens an Fällungslösungsmittel hinzu.
Zum Beispiel werden 300 Mikroliter Lysepuffer auf 1,5 Milliliter Fällungslösungsmittel mit 50% Aceton, 49,9% Ethanol und 0,1% Essigsäure gepuffert und dann über Nacht bei 80 Grad Celsius gekühlt. Pelletieren Sie die Proben erneut bei 3000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand, dann waschen Sie das Pellet, indem Sie es mit einem Spatel aufbrechen und mit der gleichen Menge an Fällungslösungsmittel mischen. Nach dem Zentrifugieren das Probenpellet 15 Minuten lang in einem Abzug an der Luft trocknen und bei 80 Grad Celsius lagern, bis es fertig ist.
Zuerst suspendieren Sie das Proteinpellet in 300 Mikrolitern frisch hergestelltem Verdauungspuffer, der 50 Millimolar Triethylammoniumbicarbonatpuffer und acht molaren Harnstoff enthält. Fügen Sie dem Protein in Lösung Dithiothreitol zu einer Endkonzentration von fünf Millimolaren hinzu, mischen und reduzieren Sie es bei Raumtemperatur für eine Stunde, dann fügen Sie Jodoacetamid zu einer Endkonzentration bei 15 Millimolaren hinzu. Mischen und bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln alkylieren.
Als nächstes fügen Sie Lys-C / Trypsin bei einem Enzym-zu-Protein-Verhältnis von 1 zu 100 hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator für vier Stunden, dann fügen Sie 50 millimolaren Triethylammonium-Bicarbonat-Puffer hinzu, um den acht molaren Harnstoff, der verwendet wird, auf weniger als einen Molar zu verdünnen. Nach Zugabe von Trypsin bei einem Enzym-zu-Protein-Verhältnis von 1 zu 100 über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator inkubieren und anschließend die Verdauung unter Zugabe von Trifluoressigsäure abschrecken. Für jedes Milligramm Startprotein eine Entsalzungskartusche mit einem Milliliter Acetonitril und dreimal mit einem Milliliter 0,1% Trifluoressigsäure konditionieren, dann die verdaute Mischung auf die Entsalzungskartusche laden und die Mischung dreimal mit einem Milliliter 0,1% Trifluoressigsäure waschen.
Als nächstes eluieren Peptide mit einem Milliliter 60% Acetonitril und 0,1% Ameisensäurelösung, dann trocknen Sie elutierte Peptide bei etwa 35 Grad Celsius mit einem zentrifugalen Vakuumkonzentrator, bis das Lösungsmittel vollständig verdampft ist. Nachdem Sie die Peptide in Wasser wieder suspendiert haben, schätzen Sie die Peptidkonzentrationen mit einem Peptidassay gemäß dem Protokoll des Herstellers, portionieren Sie die Peptide dann in 500-Mikrogramm-Aliquots und trocknen Sie sie vollständig ab. Wiegen Sie etwa drei Milligramm Watte und packen Sie sie in eine leere Schleuderspitze.
Nachdem Sie ein Gramm Titan-immobilisiertes Metallaffinitätschromatographie-Material in ein Röhrchen übertragen haben, fügen Sie 0,1% Trifluoressigsäure zu einer bekannten Materialkonzentration hinzu. Nachdem Sie genügend Schlämme zu einer Schleuderspitze gegeben haben, um 20 Milligramm Material zu übertragen, waschen Sie die Schleuderspitze durch Zentrifugieren mit 200 Mikrolitern 0,1% Trifluoressigsäure. Suspendieren Sie die Proben in 200 Mikrolitern Lade-/Waschlösungsmittel und fließen Sie durch die Schleuderspitze.
Nachdem Sie die Schleuderspitze durch Zentrifugation mit Lade-/Waschlösungsmittel gewaschen haben, waschen Sie die Schleuderspitze mit 200 Mikrolitern 80%iger Acetonitril-0,1-Ameisensäurelösung, eluieren Sie dann die Peptide mit 200 Mikrolitern E1 und E2 und analysieren Sie jede Elution separat. Wiederholen Sie den Elutionsprozess mit E3- und E4-Lösungsmitteln und kombinieren Sie die entsprechenden Elutionsfraktionen vor der nachgelagerten Analyse. Bevor Sie die Elutien bei basischem pH-Wert durchführen, konditionieren Sie das Material dreimal mit 200 Mikrolitern 90% Acetonitril in 2,5% Ammoniumhydroxid, eluieren Sie dann die Peptide mit 200 Mikrolitern E5- und E6-Lösungsmitteln und analysieren Sie diese Elutien separat nach dem Entsalzen mit einer verpackten Spitze.
Als nächstes eluieren Sie die Peptide mit 200 Mikrolitern verschiedener Konzentrationen von Acetonitril und Ammoniumhydroxid. Anschließend kombinieren Sie diese Elutions und analysieren Sie sie als eine Probe, E7, nach dem Entsalzen mit einer verpackten Spitze. Annotierte MS/MS-Spektren mit hoher Zuverlässigkeit aus N-glykosylierten und phosphorylierten Peptiden wurden mit reicher Fragmentierung der Vorläufer erhalten, was das Vertrauen in die Identifizierung erhöhte, wie sie von der Datenbanksuchsoftware zugewiesen wurde.
Peptididentifikationen wurden aus Proben gefunden, die mit der dual-funktionellen Titan-immobilisierten Metallaffinitätschromatographie-Spin-Tip-Methode über jede Elutionsfraktion angereichert wurden. Die Mehrheit der Glykopeptide eluiert in den ersten vier Fraktionen, während die Mehrheit der Phosphopeptide in den letzten drei Fraktionen eluiert, wodurch potenzielle Interferenzen bei der Ionisation verringert werden. Die glykoproteomischen Ergebnisse der dualen Titanmethode wurden mit einer reinen Ehrlich-Glykopeptid-Anreicherung verglichen, was zeigt, dass die Anteile jeder Glykanart nach dem Binning in sechs Kategorien basierend auf ihrer Zusammensetzung zwischen beiden Methoden ähnlich sind.
Phosphoproteomics-Ergebnisse aus der Dual-Titan-Methode wurden mit einer konventionellen immobilisierten Metallaffinitätschromatographie-Phosphopeptid-Nur-Anreicherung oder unter Verwendung beider Methoden verglichen. Die Mehrheit der phosphorylierten Aminosäuren wurde als Serin und Threonin identifiziert, mit etwa 1% phosphoryliertem Tyrosin. Die richtige Konstruktion der Spinspitze ist wichtig, um eine reibungslose Elution zu gewährleisten.
Stecken Sie die Baumwolle fest in die Spitze, damit das Anreicherungsmaterial auf der Baumwolle verpackt werden kann. Wir haben die dual-funktionelle Titan-IMAC-Methode zur gleichzeitigen Charakterisierung der Glykosylierung und Phosphorylierung in den meisten Geweben und des SARS-CoV-2-Spike-Proteins verwendet.
