Dieses Protokoll ermöglicht es, qualitativ hochwertige Septinkomplexe zu reinigen, und dies ist unerlässlich, um die vielen Rollen von Septinen in der Zelle zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die Synthese eines einfachen Verfahrens zur Reinigung von hochwertigem Septin mit Addgene-Plasmiden. Septine sind aufgrund ihrer vielen Wechselwirkungen in Zellen schwer zu untersuchen.
Die Schwefelrekonstitution hilft uns, diese Komplexität zu entwirren, indem wir sie in einem einfachen System untersuchen. Wir empfehlen, die Reinigung an einem einzigen Tag durchzuführen, um einen Abbau zu verhindern. Nach unserer Erfahrung erhöht dies die Lebensdauer und die Qualität des Proteins.
Um zu beginnen, züchten Sie die transformierte Bakterienkultur bei 37 Grad Celsius in einem Shaker-Inkubator, bis die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern zwei bis drei für unmarkierte Septine oder 0,6 bis 0,8 für msfGFP oder mEGFP-markierte Septine erreicht. Nach der Inkubation induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 0,5 Millimol und inkubieren Sie die Zellen, die unmarkierte Septin-Hetero-Oligomere bei 37 Grad Celsius exprimieren, für drei Stunden oder die Zellen, die msfGFP-markierte Hetero-Oligomere bei 17 Grad Celsius über Nacht exprimieren. Dann pelletieren Sie die Zellen bei 4.000 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.
Verwerfen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in 100 Milliliter Lysepuffer, um die Zellen zu lysieren. Als nächstes verwenden Sie einen Spitzenbeschaller mit 30% Amplitude, um die Zelle zu beschallen. Klären Sie das Zelllysat durch Zentrifugieren bei 20.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius und sparen Sie den Überstand.
Optional wird eine Probe zur Denaturierung der Elektrophorese entnommen, wie im Manuskript beschrieben. Für die Affinitätschromatographie von His-markierten Septinen ist eine vorverpackte Nickel-Sepharose-Hochleistungschromatographiesäule mit allen erforderlichen Puffern auszugleichen. Laden Sie den geklärten Überstand in die Säule und starten Sie das Chromatographiesystem.
Anschließend eluieren Sie die Septinkomplexe mit 50% HisTrap-Elutionspuffer bei einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute. Um eine Imidazolkonzentration von 250 Millimol zu erhalten, sammeln Sie 0,5 Milliliter Fraktionen. Überwachen Sie nun die optische Absorption des Eluats bei 280 Nanometern mit einem schnellen Proteinflüssigkeitschromatographiesystem und picken Sie die Fraktionen, die Septinkomplexe enthalten.
Für die Affinitätschromatographie von Strep-II-markierten Proteinen äquilibrieren eine vorverpackte StrepTactin Sepharose Hochleistungschromatographiesäule mit Septinpuffer. Laden Sie das aus der Nickelsäule gewonnene Septin enthaltende Fraktionen mit einer Rate von einem Milliliter pro Minute und starten Sie das Chromatographiesystem. Dann waschen Sie das gebundene Protein und eluieren Sie die Septinkomplexe mit 100% StrepTrap Elutionspuffer bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute.
Um eine Konzentration von 2,5 Millimolar Desthiobiotin zu erhalten, sammeln Sie 0,5 Milliliter Fraktionen. Wählen Sie die Fraktionen, die Septinkomplexe enthalten, wie durch die optische Absorption des Eluats bei 280 Nanometern angezeigt, die online mit einem schnellen Proteinflüssigkeitschromatographiesystem überwacht werden. Nach dem Entfernen des Desthiobiotins durch Dialyse aliquot die Proteinkomplexe in die gewünschte aliquote Größe, schnappen Sie das Aliquot ein und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius.
Für die interferometrische Streumikroskopie waschen Sie Glasobjektträger Nummer 1.5, indem Sie sie in einem Ultraschallreiniger jeweils fünf Minuten lang in Wasser, Isopropanol und erneut in entionisiertem Wasser beschallen. Trocknen Sie zwei Glasobjektträger mit einem sanften Stickstoffgasstrom. Geben Sie dann einen sieben Mikroliter Tropfen 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung auf die Mitte eines der Objektträger und legen Sie die Mitte des anderen Objektträgers auf den Poly-L-Lysin-Tropfen, wobei die beiden Objektträger orthogonal ausgerichtet werden, um eine einfache Trennung zu ermöglichen.
Nach 30 Sekunden Inkubation waschen Sie den Objektträger, indem Sie ihn einmal in ein Becherglas mit entionisiertem Wasser tauchen und zweimal direkt einen Wasserstrahl auftragen. Trocknen Sie sie mit einem Stickstoffgasstrom und diese Objektträger können etwa sechs Wochen bei Raumtemperatur unter trockenen Bedingungen gelagert werden. Schneiden Sie vor dem Experiment ein Stück von zwei mal zwei, drei mal zwei oder drei mal drei Dichtungen ab und kleben Sie sie auf den mit Poly-L-Lysin behandelten Teil eines Objektträgers, wobei Sie vermeiden, dass der Objektträger und die Dichtungen eine schmutzige Oberfläche berühren, indem Sie den Objektträger auf ein leichtes Wischertuch legen.
Drücken Sie nun die Dichtungen mit einer Pipettenspitze, um sie mit dem auf den Dichtungen vorhandenen schützenden Kunststoff zu verkleben. Als nächstes erwärmen Sie den Septinpuffer auf Raumtemperatur. Die Proteine in der Hand auftauen und anschließend auf Eis halten.
Legen Sie dann den Objektträger mit Dichtungen auf das handelsübliche Massenphotometriesystem mit 19 Mikrolitern Septinpuffer und fokussieren Sie das Mikroskop mit der Autofokus-Option. Fokussieren Sie mit den neuen Einstellungen mithilfe der Autofokus-Option. Klicken Sie zum Erstellen eines Projektordners auf Datei gefolgt von Neues Projekt, und um einen Projektordner zum Speichern von Daten zu laden, klicken Sie auf Datei und anschließend auf Projekt laden.
Dann pipettieren Sie einen Mikroliter Probe auf 19 Mikroliter Septumpuffertropfen. Mischen Sie und vermeiden Sie beim Mischen das Berühren von etwas, um die Bewegung des Objektträgers zu verhindern. Nehmen Sie dann ein Video mit 6.000 Bildern auf, indem Sie auf Aufnahme klicken.
Analysieren Sie die Videos mit der Software des Herstellers, um die Proteinmassenverteilung zu erhalten. Wenn sich die Peaks verschiedener Septin-Hetero-Oligomer-Größen zu stark überlappen oder zu viele Ereignisse detektiert werden, verringern Sie die endgültige Septinkonzentration und messen erneut. Und wenn nicht genügend einzelne Moleküle gezählt werden, erhöhen Sie die Septinkonzentration und messen Sie erneut.
Für die Septinanalyse bereiten Sie das 5X darkSPB und eine Septinmischung bestehend aus 100% dunklem Septin in sechsmal höherer Konzentration als die gewünschte Endkonzentration im Septinpuffer und einem Millimolar Dithiothreitol vor. Polymerisieren Sie dann das Septin durch Mischen von Wasser, 20% 5X darkSPB und 16,67% Septinmischung, in dieser spezifischen Reihenfolge, und inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie drei bis fünf Mikroliter Probe in ein glühendes Elektronenmikroskopiegitter hinzu und inkubieren Sie für eine Minute.
Waschen Sie nun das Gitter zweimal, indem Sie einen Tropfen darkSPB-Puffer hinzufügen und die Flüssigkeit mit einem Filterpapier absorbieren. Einmal mit Wasser waschen und 30 Sekunden mit 2%Uranylacetat inkubieren. Als nächstes tupfen Sie den Fleck ab und trocknen Sie die Probe einige Minuten an der Luft.
Dann bilden Sie die Septinbündel bei 120 Kilovolt und Vergrößerungen zwischen 5.000X und 60.000X mit einer Unschärfe von ein bis zwei Mikrometern ab. Das HisTrap- und das StrepTrap-Chromatogramm zeigten, dass die gepoolte Fraktion vom Beginn des Elutionspeaks bis zur Stabilisierung der Absorption bei etwa 250 Milliliter bzw. 50 Milliliter ging. Die Septinbänder zeigten ähnliche Intensitäten bei der Denaturierungsgelelektrophorese, was darauf hindeutet, dass die Septine intakt sind.
Bei der nativen Elektrophorese wurden die Hauptbande beobachtet, die den intakten Hetero-Oligomeren entspricht, und eine kleine Bande, die Trimoren oder Tetrameren entspricht. Das scheinbare Molekulargewicht der msfGFP-markierten Komplexe ist nicht von dem der nicht markierten Komplexe zu unterscheiden. Die Massenphotometrie detektierte intakte Oktamere und Hexamer von Septinen.
Ein zusätzlicher Peak von 241 Kilodalton zeigte das Vorhandensein von zwei Erdnussproteinen, DSep1 und mEGFP-DSep2. Transmissionselektronenmikroskopische Bilder von Septinkomplexen zeigten Stäbchen von Hexamern und Oktameren. Die msfGFP-Tags sind als Fuzzy-Dichten an den beiden Enden in Septin 2 msfGFP human septin octamers_9i1 sichtbar.
Kleine Cluster von Proteinen können im flachen TIRF-Feld beobachtet werden. Die konfokale Mikroskopie zeigte große Cluster schwimmender filamentöser Strukturen. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte kleine und große Septinbündel, die den Clustern entsprechen, die durch Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie und konfokale Mikroskopie beobachtet wurden.
Wir empfehlen, während der Reinigung immer auf Eis zu arbeiten und frische Reagenzien hinzuzufügen, die wir im Protokoll angeben. Wir interessieren uns für Wechselwirkungen von Septinen im Kontext der Zytokinese. Wir rekonstituierten Septin zusammen mit modernen Membranen Aktin und Mikrotubuli, um sie mit Mikroskopie und mehreren biophysikalischen Assays zu untersuchen.
Wir verwenden die gereinigten Septine, um zu untersuchen, wie Septine mit Aktinfilamenten, Mikrotubuli und Lipiden interagieren. Und wir verwenden die gereinigten Septine auch, um synthetische Zellen zu bauen, wo die Septine die Zellteilung erleichtern.
