Diese Methode erlaubt es, den Einfluss von Porengröße und Fließgeschwindigkeit auf die Biofilmentwicklung sowohl in natürlichen als auch in künstlichen porösen Medien systematisch zu untersuchen und damit grundlegende Mechanismen der Bioverstopfung poröser Medien zu entschlüsseln. Die Hauptvorteile der Techniken sind die höchste räumliche und zeitliche Auflösung der Veränderung und die Anpassungsfähigkeit der Plattform an eine Reihe von experimentellen Bedingungen und Anforderungen. Beginnen Sie damit, den Box-Inkubator des Mikroskops drei Stunden vor dem Experiment einzuschalten, um eine stabile Temperatur von 25 Grad Celsius zu gewährleisten.
Verbinden Sie den Einlass- und Auslassschlauch mit dem mikrofluidischen Gerät. Sichern Sie die Verbindung zwischen Schlauch und Spritze, indem Sie eine Nadel mit einem Außendurchmesser von 0,6 Millimetern in den Einlassschlauch einführen. Legen Sie das mikrofluidische Gerät, 30 Milliliter deionisiertes Wasser und 30 Milliliter Nährmedium in einen Vakuum-Exsikkator und entgasen Sie sie mindestens eine Stunde lang.
Wenn Sie fertig sind, ziehen Sie das Nährmedium und das deionisierte Wasser langsam in zwei separate 30-Milliliter-Spritzen. Montieren Sie dann das mikrofluidische Gerät am Mikroskop und legen Sie den Auslassschlauch in einen Abfallbehälter. Schließen Sie die mit deionisiertem Wasser gefüllte Spritze durch den mikrofluidischen Schlauch an den mikrofluidischen Kanal an und injizieren Sie das Wasser langsam, bis es aus dem Ausgang des Drucksensors austritt.
Füllen Sie den Drucksensor mit Wasser und spülen Sie alle Blasen aus dem Schlauch, der den mikrofluidischen Kanal und den Drucksensor verbindet. Schließen Sie den Auslass des Drucksensors mit den Schrauben, die für den Drucksensor vorgesehen sind. Füllen Sie den Rest des mikrofluidischen Kanals mit deionisiertem Wasser.
Als nächstes setzen Sie einen 1,2-Mikrometer-Filter auf die Nährmedienspritze. Entfernen Sie die Wasserspritze und schließen Sie die Spritze vorsichtig an den mikrofluidischen Einlassschlauch an. Nachdem Sie die Spritze auf die Spritzenpumpe montiert haben, spülen Sie den Kanal eine Stunde lang mit dem Nährmedium mit einer Durchflussrate von zwei Millilitern pro Stunde.
Stellen Sie anschließend die Spritzenpumpe während des Experiments auf die gewünschte Durchflussrate ein und stellen Sie den Druckwert der Drucksensoren auf Null. Als nächstes pipettiert man einen Milliliter der Bacillus subtilis NCIB 3610-Kultur mit einer optischen Dichte von 0,1 bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenfläschchen. Um die Bakterienkultur in den mikrofluidischen Kanal zu laden, legen Sie das Auslassröhrchen in das Zentrifugenfläschchen und warten Sie fünf Minuten, um mögliche Luftblasen aus dem Auslass des Röhrchens zu entfernen.
Wenn Sie fertig sind, ziehen Sie 150 Mikroliter Bakterienlösung mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Stunde zurück, bis der mikrofluidische Kanal mit der Bakterienkultur gefüllt ist. Entfernen Sie dann vorsichtig den Spritzenfilter des Nährmediums und legen Sie den Auslass in den Abfallbehälter. Lassen Sie die Bakterienzellen drei Stunden lang unter Null-Flow-Bedingungen im mikrofluidischen Kanal, damit sich ihre Oberfläche im porösen Medium festsetzen kann.
Um das Experiment zu starten, starten Sie den Durchfluss, indem Sie die Spritzenpumpe auf die gewünschte Durchflussrate einstellen und die Druckmessung bei einem Hertz starten, bevor Sie die Bilder der wachsenden Biofilme im gewünschten Zeitintervall, in der gewünschten optischen Konfiguration und in der gewünschten Vergrößerung aufnehmen. Der Prozess der Biofilmbildung wurde mittels Hellfeldmikroskopie visualisiert, wobei die Bakterienzellen und der Biofilm in den Bildern als dunklere Pixel erschienen. Während eines 24-stündigen Experiments besiedelte der zunächst zufällig wachsende Biofilm fast das gesamte poröse Medium.
Die Oberflächenbedeckung des Biofilms erfolgte bei der kleinsten Porengröße 10% schneller als bei der größten Porengröße nach 20 Stunden. Die Korrelation der Biofilmoberflächenbedeckung mit dem Druckaufbau zeigte, dass die Verstopfung im mikrofluidischen Kanal mit kleinerer Porengröße zu einer höheren Druckdifferenz zwischen dem Einlass und dem Auslass führte als in der größeren Porengröße. Die wichtigsten Aspekte, an die man sich erinnern sollte, sind, das Experiment in einer temperaturstabilen Umgebung durchzuführen und die mikrofluidische Vorrichtung und die Lösungen gut zu entgasen, um eine Blasenbildung zu vermeiden.
Diese Methode ermöglicht systematische Untersuchungen, um grundlegende Mechanismen des Biofilmwachstums sowohl in industriellen als auch in natürlichen porösen Medien im Hinblick auf den Einfluss von Fließgeschwindigkeit und Porengröße zu entschlüsseln.
