Organotypische Kulturen des humanen adulten Kortex sind bisher das einzige System zur Erprobung von Stammzelltherapien für geschädigten Kortex, das es ermöglicht, die Interaktion zwischen humanen transplantierten und menschlichen Wirtszellen zu untersuchen. Eine in Tiermodellen getestete Therapie scheitert in der Regel an der Übertragung auf das klinische Umfeld aufgrund der Unterschiede zwischen Nagetier- und menschlichen Zellen. Hier können wir transplantierte Zellen, Überleben, Differenzierung und Funktionalität in einer Mensch-zu-Mensch-Umgebung untersuchen.
Diese Methodik wird uns helfen zu verstehen, wie die neuronalen Schaltkreise im menschlichen Gehirn funktionieren, und sie wird auch die Umsetzung dieses Wissens in die klinischen Umgebungen anregen, um die funktionelle Erholung nach einer Hirnschädigung zu verbessern. Raquel Martinez-Curiel, eine Doktorandin, und Costanza Aretio-Medina, eine Masterstudentin, beide aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren. Legen Sie zunächst die Kultureinsätze mit einer Pinzette in eine Sechs-Well-Platte im Zellkulturlabor unter einer belüfteten Haube.
Geben Sie fünf Milliliter des menschlichen erwachsenen kortikalen Mediums auf die Unterseite des Einsatzes, bis es die Membran berührt. Vermeiden Sie Blasenbildung und geben Sie zwei Milliliter des Mediums auf den Einsatz. Bevor Sie die Gewebeschnitte in die Einsätze geben, balancieren Sie sie mindestens zwei Stunden lang im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Sammeln Sie das Gewebe des Patienten im Operationssaal in einem Behälter mit gefrorener, blasenförmiger und zerkleinerter Schneidlösung. Übertragen Sie den geschlossenen Behälter auf Eis sofort in den Schneidebereich des Labors. Untersuchen Sie das Gewebe und suchen Sie unter Berücksichtigung der Ausrichtung der kortikalen Schicht die beste Oberfläche, um es auf die Schneidephase des Vibratoms zu kleben.
Schneiden Sie bei Bedarf die unebene Oberfläche mit dem Skalpell ab, um das Gewebe für eine optimale Schnittausrichtung auf die Bühne zu legen. Kleben Sie dann das Gewebe mit Gewebekleber auf die Bühne. Legen Sie es in die Schneidekammer und füllen Sie es sofort mit kalter, blasenförmiger Schneidlösung.
Setzen Sie das Sprudeln während des gesamten Schneidvorgangs fort. Schneiden Sie nun koronale oder sagittale Scheiben in Abhängigkeit von der Ausrichtung von Gewebe zu Klinge, wie im Manuskript beschrieben. Legen Sie die Scheiben mit sprudelnder Schneidelösung bei Raumtemperatur in die Auffangkammer.
Sobald das gesamte Gewebe geschnitten wurde, geben Sie die Scheiben in eine sterile Petrischale mit Spüllösung bei Raumtemperatur, um überschüssige Saccharose aus den Scheiben zu entfernen, und transportieren Sie sie zum Zellkulturlabor. Als nächstes legen Sie die Gewebeschnitte einzeln auf die nassen und untergetauchten Einsätze. Wechseln Sie nach 24 Stunden das Medium, um verbleibende Saccharose oder andere Reststoffe aus dem Schneidevorgang zu entfernen.
Verwenden Sie nach zwei Wochen ein menschliches kortikales Medium für Erwachsene ohne Gentamycin. Entfernen Sie das Medium aus dem Zellkulturkolben. Am siebten Tag der Differenzierung werden kortikal präparierte GFP-lt-NES-Zellen durch Zugabe von 500 Mikrolitern Trypsin abgetrennt und 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Als nächstes fügen Sie ein gleiches Volumen des Trypsin-Inhibitors hinzu, gefolgt von fünf Millilitern DDM-Medium. Resuspendieren Sie die Zellen, geben Sie die Zellsuspension vorsichtig in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300 G.Übertragen Sie in der Zwischenzeit die Platte mit dem menschlichen Gewebe aus dem Inkubator in die Haube und entfernen Sie zwei Milliliter Medien von der Oberseite des Einsatzes. Am Ende der Zentrifugation wird der Überstand entfernt, die Zellen in einer kalten, reinen Basalmembranmatrix resuspendiert und die Rente in ein kleineres Röhrchen überführt.
Sammeln Sie die Zellsuspension in einer kalten Glaskapillare, die zum Absaugen mit einem Gummisauger verbunden ist. Injizieren Sie die Zellsuspension als winzige Tropfen, indem Sie den halbtrockenen Gewebeschnitt an verschiedenen Stellen stechen. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius erstarren.
Übertragen Sie dann die Platte aus dem Inkubator zurück in die Haube und geben Sie vorsichtig zwei Milliliter menschliches kortikales Medium auf die Oberseite des Einsatzes, um das Gewebe vollständig einzutauchen. Das akute menschliche adulte kortikale Gewebe zeigte das Vorhandensein von Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten, die eine optimale Erhaltung des Gewebes zeigten. Das Gewebe zeigte die Expression der neuronalen Marker NeuN und Map2 nach zwei Wochen Zellkultur.
Die Aufzeichnung der gesamten Zell-Patch-Clamp zeigte, dass Neuronen ein anhaltendes Ruhemembranpotential und einen Membraneingangswiderstand aufwiesen, vergleichbar mit Neuronen aus akuten Präparaten. Die Zellen waren etwas weniger aktiv als in frischem Gewebe, obwohl die meisten Zellen in der Lage waren, mindestens ein, wenn nicht sogar mehrere Aktionspotentiale abzufeuern. Das akute kortikale Gewebe zeigte die Expression der Mikrogliamarker Iba1 und Tmem119.
Nach zwei Wochen in Kultur wurden die Mikroglia weniger verzweigt und erhielten eine stärker aktivierte Morphologie als im akuten Gewebe. Vier Wochen nach der Ex-vivo-Transplantation zeigten die transplantierten GFP-lt-NES-Zellen ausgedehnte Neuriten mit ausgedehnten und komplexen Arborisierungen in der gesamten organotypischen Kultur. Kaum transplantierte Zellen überlebten in schlecht erhaltenem Gewebe.
Trümmer und unspezifische Markierungen von Antikörpern auf toten Zellen wurden im gesamten menschlichen Schnitt weitgehend beobachtet. Im Falle einer erfolgreichen Transplantation wurden die Zellen funktionell aktiv und reife Neuronen zeigten repetitive und oft spontane Aktionspotentiale. Schnelles nach innen gerichtetes Natrium, langsame Kaliumströme nach außen und ein gewisses Maß an synaptischer Aktivität deuten auf eine funktionelle Integration des Transplantats in das Wirtsgewebe vier Wochen nach der Transplantation hin.
Je schneller das menschliche Gewebe verarbeitet wird, sobald es den Operationssaal verlassen hat, desto höher ist die Lebensfähigkeit des Systems und der Erfolg des experimentellen Verfahrens.
