A maioria dos trabalhos básicos e translacionais vem de animais anestesiados. Os anestésicos podem adicionar variáveis de confusão à análise e interpretação dos dados. Este trabalho permite que imagens acordadas em ratos contornem esse problema.
Este design é bastante simples. Todo o conjunto é leve, para não prejudicar a vida normal do animal. Isso significa que ele também pode ser usado para imagens crônicas de longo prazo.
Quem ajudará a demonstrar esse procedimento será o Dr. Mehwish Bhatti, pós-doutor sênior do nosso laboratório. Comece fazendo o implante de cabeça usando um software CAD para obter imagens da área posterior ao bregma e adjacente à linha média centrada no córtex somatossensorial. Certifique-se de que o implante de cabeça cubra uma área de 0,9 a 1,9 milímetros no crânio longe da área de imagem.
Use apenas três parafusos para ancorar o implante de cabeça no crânio do rato. Projete todos os orifícios do parafuso no lado oposto da linha média na parte contralateral do hemisfério da imagem. Para permitir que os fios fixem a tampa da cabeça ao implante de cabeça, coloque uma barra oca na parte superior do implante de cabeça.
Em seguida, projete a tampa, garantindo que ela cubra totalmente a área de imagem e a proteja de qualquer trauma. Adicione uma curvatura à touca para que ela se alinhe ao formato da cabeça sem causar dificuldade às atividades diárias do animal nas gaiolas enriquecidas padrão. Corte o lado interno da tampa da cabeça em uma forma retangular mais larga para que a parte superior do implante de cabeça possa se encaixar nela.
Perpendicularmente a esse retângulo, corte duas outras regiões retangulares para ancorar a calota craniana ao implante cefálico. Para fixar a tampa da cabeça na cabeça do rato, passe os fios através da barra oca superior do implante de cabeça. Projete a estrutura da cabeça de modo que uma parte cortada possa se mover através da barra superior do implante de cabeça e seja fixada usando uma braçadeira.
Para tornar o lado contralateral acessível para aquisição de imagens, incline a outra parte do corte para fornecer força extra para manter a cabeça do rato fixa. Imprima o implante de cabeça e a tampa da cabeça usando a impressora 3D. Medir o peso do animal para calcular a quantidade de anestésico a ser administrado.
Anestesiar o animal injetando pentobarbital sódico por via intraperitoneal. Várias alternativas anestésicas podem ser utilizadas nessa cirurgia, como isoflurano, cetamina ou xilazina. Injete atropina por via intramuscular para reduzir as secreções de muco durante a respiração.
Usando um aparador de cabelo, raspe a cabeça do rato começando entre os olhos até a parte de trás das orelhas cinco milímetros centrados em torno da linha média. Em seguida, monitore a saturação parcial de oxigênio e a frequência cardíaca usando um oxímetro de pulso e uma sonda do monitor de frequência cardíaca fixada na pata traseira do rato. Limpe a cabeça do rato e a área circundante três vezes com Betadine e lenços umedecidos com álcool a 70% alternativamente.
Fixe o rato em um sistema estereotáxico. Em seguida, insira uma sonda retal lubrificada com vaselina para medir a temperatura corporal do rato e mantê-la através do sistema de feedback da manta térmica para evitar hipotermia após a administração do anestésico. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
Administrar anestésico local a 2% por via subcutânea sobre o sítio cirúrgico e três milímetros de solução de Ringer com lactato em temperatura ambiente por via subcutânea para evitar desidratação e fornecer nutrição durante a cirurgia. Usando tesouras cirúrgicas afiadas, remova a parte da pele sobre o local cirúrgico. Dissecção e remover parte da pele entre a orelha e o olho na parte temporal da cabeça.
Usando um bisturi, remova o tecido cutâneo subjacente para expor o crânio. Em seguida, limpe o crânio com gaze de algodão esterilizada. Cortar o músculo temporal e expor a área do crânio no hemisfério contralateral para o implante cefálico.
Coloque o implante de cabeça no crânio para verificar a localização dos parafusos de ancoragem para o implante. Agora marque o crânio usando tinta da Índia para perfurar os parafusos com a broca um. Faça os furos da rebarba para os parafusos usando broca dental broca três e rosqueie o implante de cabeça no lugar.
Seque o crânio usando gaze estéril e aplique uma fina camada de adesivo de tecido ao redor e abaixo do implante da cabeça para colá-lo ao crânio. Use cimento dental para apoiar o implante da cabeça no lugar e deixe o cimento secar por dois a três minutos. Além disso, use broca dentária broca três para diminuir a espessura de uma área de 7,5 milímetros por 7,5 milímetros no lado esquerdo do crânio logo posterior ao bregma e lateral à linha média para 50 micrômetros.
Aplique pomada antibiótica tópica sobre o local cirúrgico e, em seguida, cubra-o com uma fina camada de borracha de silicone para proteger o crânio fino. Em seguida, cubra o local cirúrgico usando a touca e fixe-a no lugar com os dois pequenos pedaços de fios que atravessam o implante da cabeça e a touca. Aplique borracha de silicone para cobrir a cabeça e o crânio para estabilizar ainda mais a cabeça do rato.
Administrar buprenorfina e antibióticos por via intraperitoneal para controlar a dor e inflamação e prevenir a infecção, respectivamente. Os sinais de imagem óptica da resposta somada de um rato acordado e uma única tentativa de um rato anestesiado são mostrados. A resposta funcional do rato com cabeça fixa acordado é 140 vezes mais forte do que a do rato anestesiado.
Tenha cuidado para não adicionar muito cimento sobre a placa principal. Pode impedir que a tampa seja fixada corretamente. Este método pode ser amplamente aplicado para neuroimagem de crânio fino fixo da cabeça do acordado.
Com craniotomias, pode ser estendido a outros protocolos de neuroimagem, incluindo ultrassom funcional, imagem de cálcio e imagem de fluorescência. A imagem em vigília permitirá um novo corpo de trabalho sem as variáveis de confusão introduzidas com os anestésicos.
