Der synaptonemale Komplex ist eine Schlüsselkomponente für die Meiose. Um seine Funktion zu untersuchen, müssen wir auch seine Struktur verstehen, für die sich die hochauflösende Mikroskopie als unglaublich nützlich erwiesen hat. Wir haben unser Protokoll optimiert, um immungefärbte C.elegans-Gonade stabil an einem Deckglas zu befestigen, was dazu beiträgt, die Auflösung in intaktem Gewebe bis auf 30 Nanometer zu verbessern.
Das Design von Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie-Experimenten, die anschließende Analyse und auch die Interpretation der Daten kann sehr anspruchsvoll sein und sollte am besten zusammen mit einem Experten eingerichtet werden. Ivana Cavka, Doktorandin im Labor, demonstriert das Verfahren. Die Aufnahme der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie-Bilder wird auch von Rory Power, einem Optikingenieur am MBL Imaging Center, gezeigt.
Beginnen Sie mit der Auswahl altersgerechter Caenorhabditis elegans-Würmer aus NGM-Agarplatten. Übertragen Sie die Würmer in einen 30-Mikroliter-Tropfen EBTT auf einem Deckglas. Waschen Sie die Würmer mit zusätzlichen 30 Mikrolitern EBTT.
Entfernen Sie 30 Mikroliter der Lösung und lassen Sie einen 30-Mikroliter-Tropfen mit den Würmern auf dem Deckglas zurück. Verwenden Sie eine Skalpellklinge, um die Köpfe und / oder Schwänze der Würmer abzuschneiden, um die Gonade zu extrudieren. Bei einer erfolgreichen Dissektion wird das Gonadengewebe vollständig außerhalb des Wurmkörpers extrudiert.
Pipettieren Sie 30 Mikroliter der Fixierlösung in den Tropfen der sezierten Würmer. Durch Pipettieren mischen und die Proben eine Minute lang fixieren lassen. Stoppen Sie die Fixierung genau nach einer Minute, indem Sie die Würmer mit einer 20-Mikroliter-Pipette auf ein mit TBST gefülltes PCR-Röhrchen überführen.
Führen Sie dann eine Wäsche durch, indem Sie die sezierten Proben auf einer Mini-Tischzentrifuge drehen. Sobald der Überstand entfernt ist, resuspendieren Sie die Würmer in 200 Mikrolitern frischem TBST. Nach dem letzten Waschen die Würmer in 200 Mikrolitern PBST resuspendieren und das PCR-Röhrchen auf Eis legen.
Drehen Sie die sezierten Proben auf einer Mini-Tischzentrifuge und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 50 bis 100 Mikroliter kaltes Methanol hinzu, mischen Sie durch Pipettieren und lassen Sie die Proben 30 bis 60 Sekunden in Methanol auf Eis. Waschen Sie die Proben zweimal mit 200 Mikrolitern PBST.
Nachdem Sie die Proben gedreht und den Überstand entfernt haben, fügen Sie die blockierende Lösung zu den Proben hinzu und halten Sie sie 45 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie die primären Antikörper gegen die Arbeitslösungen im Blockierpuffer. Drehen Sie die Proben auf einer Mini-Tischzentrifuge, entfernen Sie die blockierende Lösung und fügen Sie 30 bis 50 Mikroliter der primären Antikörperlösung hinzu.
Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben dreimal in PBST. Verdünnen Sie die beschrifteten Fab prime zwei Fragmente zu den Arbeitslösungen im Blockierpuffer.
Nach dem dritten Waschgang die Proben herunterschleudern, den Überstand entfernen und 30 bis 50 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung hinzufügen. Die Probe in eine dunkle Kammer geben und 30 Minuten bis zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Dann waschen Sie die Proben dreimal mit PBST für fünf bis 15 Minuten.
Schleudern Sie die gefärbten Proben herunter und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 50 Mikroliter PBST hinzu und übertragen Sie die gefärbten Würmer auf ein Deckglas. Pipettieren Sie 5,7 bis 6,3 Mikroliter der postfixativen Lösung auf ein Poly-L-Lycin-Deckglas.
Pipettieren Sie die sezierten Würmer im gleichen Volumen ab und geben Sie sie in den Fixiertropfen auf dem Poly-L-Lysin-Deckglas. Decken Sie die Probe mit einem kleinen Deckglas ab. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einem kleinen Stück Filterpapier und fixieren Sie die Probe für drei bis fünf Minuten in einer dunklen Kammer.
Frieren Sie die Proben ein, indem Sie sie auf einen Aluminiumblock in Trockeneis legen. Entfernen Sie nach mindestens 20 Minuten das kleinere Deckglas mit einem Rasierer. Tauchen Sie das Deckglas für etwa 10 Sekunden in ein 50 Milliliter konisches Röhrchen mit eiskaltem PBS oder Methanol, das bei minus 20 Grad Celsius gekühlt ist.
Legen Sie das Deckglas in eine Vertiefung einer mit PBST-Puffer gefüllten Platte mit sechs Vertiefungen. Entfernen Sie das PBST aus dem Brunnen, fügen Sie frisches PBST hinzu und lassen Sie die Probe fünf Minuten stehen. Nach erneutem Waschen mit PBST lassen Sie die Proben bis zur Bildgebung bei vier Grad Celsius.
Beurteilen Sie vor der Bildgebung die Qualität der Probenmontage unter einem Stereomikroskop. Wenn Sie den hier gezeigten maßgeschneiderten Probenhalter verwenden, wickeln Sie den Magnetring mit Parafilm ein und bereiten Sie dann einen Milliliter Bildpuffer vor. Nehmen Sie ein Deckglas von der Sechs-Well-Platte.
Legen Sie es in die speziell angefertigte Halterung und befestigen Sie das Deckglas mit dem mit Parafilm umwickelten Magnetring in der Halterung. Pipettieren Sie vorsichtig den Bildpuffer in der Kammer, die durch den Magnetring auf der Oberseite der Probe erzeugt wird, und verschließen Sie die Kammer mit Parafilm. Um die Probe zu montieren, fügen Sie einen Tropfen Tauchöl zum Clean Oil Objektiv hinzu.
Ohne Luft in das Tauchöl einzuführen, legen Sie den Probenhalter mit der montierten Probe vorsichtig auf den Mikroskoptisch. Bewegen Sie die Piezostufe mithilfe des EMU-Plug-in-Fensters in MicroManager 2, bis das Signal des Fokus-Lock-Lasers an der Quadranten-Fotodiode erkannt wird. Erfassen Sie ein Back-Focal Plane-Bild mit geringerer Leistung mit einem Laser bei 640 Nanometern Anregung, um das Fehlen von Luftblasen im Immersionsöl zu bestätigen.
Lokalisieren Sie das Gonadengewebe mit der Hellfeldbeleuchtung. Konzentrieren Sie sich mit einer Beleuchtung mit geringer Intensität bei 640 Nanometern auf den Gewebeabschnitt, der viele synaptonemale Komplexe enthält. Belichten Sie die Probe bei hoher Bestrahlungsstärke mit Beleuchtung bei 640 Nanometern für etwa 30 Sekunden, bis eine angemessene Blinkrate erreicht ist.
Erfassen Sie 200.000 Bilder mit einer Belichtungszeit von 20 Millisekunden mit dem mehrdimensionalen Erfassungswerkzeug in MicroManager 2. In der Zwischenzeit richten Sie die UV-Aktivierung mit der Aktivierungsoption des EMU-Plugins ein, um die gewünschte Blinkrate beizubehalten. Die unterste Ebene der meiotischen Kerne, die synaptonemale Komplexe enthalten, wurde innerhalb einer Caenorhabditis elegans-Gonade unter Verwendung von HTP-3- und SYP-5-Färbung visualisiert.
Die Chromosomenachsen im C-Terminus von SYP-5 HA waren in allen drei Dimensionen in synaptonemalen Komplexen in der Nähe des Deckglases gut aufgelöst. Die Auflösung verschlechtert sich jedoch in synaptonemalen Komplexen, die sich in einem Abstand von fünf Mikrometern vom Deckglas befinden, aufgrund von Lichtstreuung und sphärischen Aberrationen. Bilder, die in verschiedenen Piezoabständen vom Deckglas aufgenommen wurden, zeigten, dass das abgebildete Gewebe nicht weiter als zwei Mikrometer vom Deckglas entfernt sein sollte.
Das Probenvorbereitungsprotokoll kann auch mit der TauSTED-Mikroskopie verwendet werden. Mit der optimierten Probenvorbereitung wurden HTP-3 in den Chromosomenachsen und die C-Termini von SYP-5 im zentralen Bereich in Frontalansicht und leicht geneigter Ansicht aufgelöst. Um die beste Auflösung zu erhalten, müssen die Gonaden eng mit dem Deckglas vernetzt sein, um sicherzustellen, dass die synaptonemalen Komplexe nicht weiter als zwei Mikrometer vom Deckglas entfernt sind.
Wir verwenden dieses Protokoll nicht nur für die Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie, sondern auch für die Mikroskopie der stimulierten Emissionsverarmung. Es kann auch für andere hochauflösende Mikroskopietechniken nützlich sein.
