Grant: 5RO1GM086447-02.

Ein. Probenvorbereitung <ol><li> Beimpfen LB Medium mit einer Einzelkolonie des Stammes JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Über Nacht wachsen in einem Schüttler bei 37 ° C. </li><li> Verdünnen Sie die Kultur 1:1,000 in M9 + minimal media [M9 Salze, 0,4% Glucose, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, MEM Aminosäuren und Vitamine] und wachsen bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD 600 = 0,2-0,3) in Gegenwart von Chloramphenicol (150 ug / ml) bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Erbrechen Kultur mit 20 uM IPTG für 2 Stunden (siehe Anmerkung Nr. 1). </li><li> Pellet Kultur in Mikrozentrifuge (8.000 UpM, 1 min) und Resuspension in einem gleichen Volumen von M9 +; wiederholen. Nach der zweiten Resuspension weiterhin Wachstum bei RT für 2 h. </li><li> Fix induzierten Kultur mit 4% Paraformaldehyd in PBS (pH = 7,4) bei RT für 40 min. Pelletkultur und resuspendieren in einem gleichen Volumen von PBS; wiederholen. Wenn Bildgebung lebender Zellen, überspringen Fixierung, Pellet Kultur und resuspendieren mit dem gleichen VolumenM9 - [M9 Salze, 0,4% Glucose, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, MEM Amino Acids]; wiederholen. </li><li> Verdünnen Goldperlen 1:10 mit resuspendierten Kultur. Bewerben Probe vorbereiteten Bildgebung Kammer (siehe Schritt 2,4). </li></ol> [1] Hinweis: Die obige Induktion Protokoll (Schritte 1.1-1.3) hat für den Ausdruck System der Belastung JB281 optimiert. Detaillierte Induktionsbedingungen für andere Expressionssysteme oder Proteine ​​von Interesse zu variieren. 2. Versammlung der Imaging Chamber <ol><li> Einen 3% (w / v) Agarose-Lösung in M9 -. Melt Agarose bei 70 ° C in einer Bank-Oberhitze Block für 40min. Laden geschmolzen Agarose bei 50 ° C für bis zu 5 Stunden. </li><li> Ein sauberes microaqueduct Folie in der oberen Hälfte der Abbildungskammer mit den Elektroden nach unten. Richten Sie die untere Dichtung auf der microaqueduct slide so die Durchblutung Kanäle abzudecken. </li><li> Anwenden ~ 50 ul der geschmolzenen Agarose zur Mitte des GlasesRutsche. Unmittelbar oben auf der Agarosegel Tröpfchen mit einem sauberen, trockenen Deckglas. Sollte das Gel bei Raumtemperatur für 30 min verfestigt. <ol><li> Um Deckgläser reinigen: arrangieren Deckgläser in einer keramischen Halter und beschallen für 20 min in rotierenden Bäder von Aceton, Ethanol und 1M KOH in Gläsern. Wiederholen Zyklus dreimal für insgesamt 9 sonications, gefolgt von einem einzelnen Beschallung in dH 2 O. Bewahren Sie die gereinigten Deckgläser in frischem dH 2 O. Vor dem Gebrauch trocken blasen Deckgläser mit gefilterter Luft. </li></ol></li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas, so dass Gel-Pad auf der microaqueduct Folie. Sofort im 1 ul Zellkulturprobe (siehe Schritt 1,6) an die Spitze des Gel-Polster. Warten für ca. 2 Min., wodurch Lösung durch das Gel-Pad absorbiert werden. Top-Gel-Pad mit einem neuen, sauberen, trockenen Deckglas. Montieren Sie den gesamten Imaging-Kammer nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop, Kamera und Laser. Öffnen MetaMorph weichenware (Molecular Devices). </li><li> Zeigen entsprechender Anregung / Emission Filter in der Bildgebung Pfad (Abbildung 1). </li><li> Set Laserleistungen und Akquisition Einstellungen entsprechend an. <ol><li> 488-nm-Laser = 15 mW (siehe Hinweis Nr. 2) </li><li> 561-nm-Laser = 75 mW </li><li> 405-nm-Laser = 2 mW ± Graufilter (Siehe Anmerkung # 3) </li></ol></li><li> Sperren Bildgebung Kammer in der Bühne über den ergänzenden Tischadapters. </li><li> Eine geeignete Bildgebung Region (100x100 Pixel), die homogen von allen drei Laser beleuchtet wird. </li><li> Identifizieren eines Probenbereichs, der beide Zellen und Bezugsmarkierungen (Goldkügelchen) in enger Nachbarschaft aber nicht überlappenden enthält. </li><li> Fokus auf der Oberfläche von Zellen am nächsten zu dem Deckglas. Erwerben Sie ein Hellfeld-Bild mit 50 ms Integrationszeit und den Fokus 0,5 um in die Probe (Abbildung 3Ai). </li><li> Erwerben Ensemble grüne Fluoreszenz Bild mit Anregung aus dem 488-n<html> m-Laser mit einer 50 ms Integrationszeit (Abbildung 3Aii). </li><li> Erwerben Sie Streaming-Video in roten Kanal mit kontinuierlicher Beleuchtung von 405-nm-und 561-nm-Laser. Für fixierten Zellen wird ein 50 ms Frame-Rate für eine Gesamtmenge von 20.000 Frames (~ 17 min insgesamt) mit dem 405-nm Laserleistung hochgefahren um ca. 10% alle 1.000 Frames (siehe Anmerkung Nr. 4) verwendet. Für lebende Zellen ist ein 10 ms Frame-Rate für insgesamt 3000 Frames (~ 30 s gesamt) bei einem konstanten 405-nm Laserleistung verwendet. </li><li> Verschieben des Fokus wieder auf die untere Oberfläche der Zellen und andere erwerben Hellfeld Bild wie in Stufe 3.7. </li></ol> [2] Bemerkung: Die integrierte Intensität der grünen Fluoreszenz einer Zelle ist direkt proportional zu der Gesamtzahl der-FtsZ mEos2 Moleküle in der Zelle exprimiert wird. Die 488-nm Anregungsleistung und Ensemble Fluoreszenz Akquisition Einstellungen konstant gehalten werden für alle Zellen, so dass die relative FtsZ-mEos2 Expressionsniveaus in verschiedenen Zellen verglichen werden können. nhalt &quot;&gt; [3]. Hinweis: Die fixierten Zellen werden mit dem Neutral Density (ND)-Filter (Abbildung 1, Optical Component # 5) an Ort und Stelle abgebildet, um eine langsame Aktivierung Rate, so dass jedes einzelne Molekül genau identifiziert werden können erreichen die ND-Filter entfernt wird, wenn Echtzeit-Bildgebung Zellen, um die Aktivierung zu erhöhen, unter Beibehaltung einer geringen Wahrscheinlichkeit von zwei Molekülen, die gleichzeitig in einem beugungsbegrenzten Bereich aktiviert. Je schneller sich die an lebenden Zellen benötigt wird, um die gesamte Messzeit zu verringern, wodurch &quot;Einfrieren&quot; die Z-Ring in der Zeit und die Begrenzung der Wirkung von Lichtschäden an der Zelle. [4] Bemerkung: Die Zahlen von Rahmen akquiriert wurden für unser System optimiert und sind abhängig von der speziellen zellularen Struktur, Etikettieren Dichte, Aktivierungsrate und ob Absaugen der gesamte Pool von Fluorophoren für die Analyse wichtig. In lebenden Zellen, ist es wichtig, eine ausreichende Anzahl von Lokalisierungen in einer so kurzen Frist von ti zu erhaltenmir als möglich zu vermeiden, die Unschärfe des Bildes aufgrund einer Bewegung der Zellstruktur. 4. PALM Bild Construction <ol><li> Bestimmen Schwerpunkt Position jedes festgestellte Lichtpunkt. <ol><li> Laden Sie das Bild Stapel in Matlab (MathWorks, Inc). </li><li> Beschneiden Bildstapels auf einen Bereich um eine Zelle, die alle Fiducial Kügelchen ausschließt. </li><li> Wählen einer Intensität Schwelle für Spotdetektion über dem Hintergrund Ebene, aber unterhalb der durchschnittlichen Spotintensität ist. Wir berücksichtigen für die Variation in Hintergrundpegel während eines Experiments durch Berechnung des laufenden Durchschnitts der maximalen Intensität unter Verwendung eines Frame-Fensters 150. Die Intensität Schwellwert für jeden Rahmen wird dann interpoliert aus den laufenden Durchschnittswerte. </li><li> Subtrahieren Sie die jeweilige Schwelle von jedem Rahmen. Prospective Spots als drei benachbarte Pixel mit Intensitäten oberhalb der Schwelle identifiziert. </li><li> Den Fluoreszenzintensität jedem Interessenten vor Ort zu einem zweidimensionalen Gaussian Funktion [Gleichung # 1] unter Verwendung eines nichtlinearen Least-Squares-Algorithmus (Abbildung 2). Die Lokalisierung Präzision jedes Spots wird anhand der Gesamtzahl der detektierten Photonen [Gleichung Nr. 2]. Jede schlecht fit Spot mit einer Lokalisierung Genauigkeit größer als 20 nm (fixierten Zellen) bzw. 45 nm (lebende Zellen) wird verworfen (siehe Anmerkung Nr. 5). Jeder Spot mit einer Intensität größer als das Zweifache der mittleren Intensität, möglicherweise aufgrund überlappender Emittern, wird ebenfalls verworfen. </li><li> Für fixierten Zellen zu entfernen wiederholte Beobachtungen des gleichen Moleküls durch Nichtbeachtung jede Stelle, deren Schwerpunkt Position ist innerhalb von 45 nm einer anderen Stelle, die sie von 6 Frames oder weniger voraus. Für lebende Zellen, werden alle Stellen erhalten. </li></ol></li><li> Kalibrieren Probe Drift mit Bezugspunktmarkiereinrichtungsanordnung Bewegung. <ol><li> Crop aus einem 10x10 Pixel Bereich um eine Bezugspunktmarkiereinrichtungsanordnung. </li><li> Subtrahieren Sie die jeweilige Schwelle in 4.1.3 aus jedem Rahmen bestimmt. </li><li> Den Intensitätsprofil in jedemRahmen über kleinsten Quadrate Anpassungsalgorithmus Annahme einer zweidimensionalen gaußschen Form. </li><li> Berechnen Verschiebung zwischen Zentroidpositionen relativ zu dem Rahmen 1. </li></ol></li><li> Korrigieren des Schwerpunktes Position jedes einzigartigen Molekül in 4,1 mit der entsprechenden Probe in 4,2 Drift berechnet identifiziert. Vergleichen Sie die Hellfeld Bilder in 3,7 und 3,10 erworben. Wenn Zellen beobachtet werden, um relativ zu den Bezugsmarkierungen bewegen, werden die Daten verworfen. </li><li> Überlagern alle korrigierten Zentroidpositionen auf einem einzigen Bild von 15x15 nm Pixeln. Plotten jedes einzigartigen Molekül als Einheit-, zwei-dimensionalen Gauß-Profil an der Schwerpunktposition mit einer Standardabweichung gleich der Lokalisierungsgenauigkeit [Gleichung # 2] zentriert. Dies führt zu einer Wahrscheinlichkeitsdichte Karte, wo die Intensität eines Pixels proportional ist zur Wahrscheinlichkeit des Findens eines Moleküls in diesem Pixel (Abbildung 3Aiv). </li><li> Vergleicht PALM Bilder Ensemble Bildern. <ol><li> Replot das centroID Positionen wie in 4.4, aber in einer Ebene mit 150x150 Pixel nm und einer Standardabweichung von höchstens 250 nm aufweisen. Dies erzeugt ein Bild, das einen PALM beugungsbegrenzte Abbildung, die verwendet werden, um an den beugungsbegrenzten, Ensemble Bild in 3,8 (Abbildung 3Aiii) erworben werden kann Vergleichen nachahmt. </li><li> Um zu bestätigen, dass die detektierten Moleküle repräsentativ für die gesamte Bevölkerung sind, vergleichen Sie das rekonstruierte Ensemble Bild (Abbildung 3Aiii, Schritt 4.5.1) mit dem experimentellen Ensembles Fluoreszenz Bild (Abbildung 3Aii, Schritt 3,8), um zu bestätigen, dass beide Bilder Strukturen ähnlicher Gestalt zeigen , Orientierung und relative Intensität. </li></ol></li></ol> [5] Hinweis: Die mindestens erforderliche Lokalisierung Präzision wurde empirisch für jede bildgebenden Verfahren durch Auftragen der Genauigkeiten aller Moleküle für eine bestimmte Probe und die Auswahl eines geeigneten Cutoff bestimmt. 5. PALM Image Analysis <ol><li> Mess-Z-Ring Width und Durchmesser. <ol><li> Drehen Sie den PALM Bild, um so vertikal Orientierung der langen Achse der Zelle (Abb. 4A). </li><li> Crop aus dem zellulären Bereich, der die Z-Ring. </li><li> Berechnen des kumulativen Intensität durch Projizieren eines Intensitätsprofil entlang der Zelle Längsachse. </li><li> Montieren des Intensitätsprofils einer Gaußschen Verteilung. Die Ringbreite ist als die volle Breite halbes Maximum (FWHM) der angepassten Gaußverteilung (4B) definiert. </li><li> Projizieren Sie das kumulative Intensitätsprofil 5.1.2 entlang der Zelle kurzen Achse. Der Ringdurchmesser ist als die volle Länge des Intensitätsprofils (4C) definiert. </li></ol></li><li> Plotten FtsZ Dichte (siehe Anmerkung 6). <ol><li> Replot die Zentroidpositionen wie in (4.4), aber ohne das Gauss-Profil, so dass jede einmalige Molekül einen Wert von 1 gegeben wird und übertragen auf ein einzelnes Pixel entsprechend seiner Schwerpunktsposition. Auf diese Weise kann die Intensität von jedemPixel repräsentiert die Gesamtzahl der Moleküle in diesem Pixel detektiert. Die Dichte PALM Bild kann auch visualisiert werden als Kontur-Plot (Abbildung 5E). </li></ol></li><li> Bestimmung der räumlichen Auflösung. <ol><li> Theoretisch-erreichbare räumliche Auflösung: Erstellen Sie eine repräsentative PSF für die gesamte Stichprobe mit dem durchschnittlichen ermittelt Lokalisierungsgenauigkeit aller erkannten Moleküle und die Berechnung der FWHM (Gleichung # 3). </li><li> Experimentell erreicht räumliche Auflösung: Berechnung der durchschnittlichen Verschiebung zwischen repeat Beobachtungen desselben Moleküls. </li></ol></li></ol> [6] Bemerkung: Wir verwendeten Totalreflexion PALM (TIR-PALM, Abbildung 1 und 5), um die Aktivierung und Erregung, um eine dünne Schicht (~ 200 nm) oberhalb der Zelle / Glas-Grenzfläche zu beschränken. so dass nur FtsZ Moleküle mit der Membran am nächsten zu dem Deckglas assoziiert erkannt werden.

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	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. 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Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

PALM Bilder enthalten Informationen über Molekül Zählungen und Positionen innerhalb einer Zelle, so dass detaillierte Analyse der Verteilung und Anordnung der Target-Protein-Moleküle, die nur schwer mit anderen Mitteln erreichen. Nachfolgend skizzieren wir Vorsichtsmaßnahmen getroffen, um eine genaue quantitative Informationen zu extrahieren und gleichzeitig die biologische Relevanz der PALM Bilder werden sollte. Wir auch die Informationen, die am besten erhalten werden kann mit live vs fixierten Zellen. Schließli...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 50 x MEM Amino Acids </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x MEM Vitamine </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td> Electron Micrsocopy Sciences </td><td> 15.710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG Agarose </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 nm Gold Perlen </td><td> Microspheres-Nanospheres </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 Imaging Chamber </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stufe Adapter </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Inverses Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1,45 NA, 60x Objective </td><td> Olymp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD Kamera </td><td> Andor Technology </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm Sapphire Laser </td><td> Kohärent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm Sapphire Laser </td><td> Kohärent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405-nm CUBE Laser </td><td> Kohärent </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

Bakterielle Zellteilung erfordert die koordinierte Anordnung von mehr als zehn essentiellen Proteine ​​bei midcell 1,2. Im Mittelpunkt dieses Verfahrens ist die Bildung eines ringähnlichen Suprastruktur (Z-Ring) durch die FtsZ Protein bei der Teilung Plan 3,4. Der Z-Ring besteht aus mehreren einsträngige FtsZ Protofilamenten, und das Verständnis der Anordnung der Protofilamente innerhalb der Z-Ring wird einen Einblick in den Mechanismus der Z-Ring Montage und ihrer Funktion als Krafterzeuger 5,6 geben. Diese Information ist bisher unklar in herkömmlichen Fluoreszenz-Mikroskopie und Elektronenmikroskopie aufgrund der aktuellen Einschränkungen. Konventionellen Fluoreszenzmikroskop ist nicht ein hochauflösendes Bild des Z-Ring aufgrund der Beugungsgrenze des Licht (~ 200 nm) bereitzustellen. Electron cryotomographic Bildgebung erkannt hat FtsZ Protofilamente in kleinen C. verstreut crescentus Zellen 7, ist jedoch schwierig, zu größeren Zellen wie geltenE. coli oder B. subtilis. Hier haben wir die Anwendung eines Super-Resolution-Fluoreszenz-Mikroskopie-Methode zu beschreiben, Photoaktiviertes Localization Microscopy (PALM), quantitativ zu charakterisieren die strukturelle Organisation des E. coli Z-Ring 8. PALM Bildgebung bietet sowohl eine hohe räumliche Auflösung (~ 35 nm) und spezifische Kennzeichnung für die eindeutige Identifizierung von Zielproteinen zu ermöglichen. Wir markierten FtsZ mit dem photoaktivierbaren Fluoreszenzprotein mEos2, die von grünen Fluoreszenz (Anregung = 488 nm) nach rot schaltet Fluoreszenz (Anregung = 561 nm) bei Aktivierung bei 405 nm 9. Während eines Experiments PALM werden einzelne FtsZ-mEos2 Moleküle stochastisch aktiviert und die entsprechenden Zentroidpositionen der einzelnen Moleküle sind mit &lt;20 nm Genauigkeit bestimmt. Ein Super-Resolution-Bild der Z-Ring wird dann durch die Überlagerung der Zentroidpositionen aller erkannten FtsZ-mEos2 Moleküle rekonstruiert. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde festgestellt, dass der Z-Ring einen festen Breite von ~ 100 nm aufweist und aus einem Bündel von losen FtsZ Protofilamenten, die miteinander überlappen, in drei Dimensionen besteht. Diese Daten liefern ein Sprungbrett für weitere Untersuchungen der Zellzyklus abhängigen Veränderungen der Z-Ring 10 und kann auf andere Proteine ​​von Interesse angewendet werden.

Veranschaulicht in 3Aiv ist eine zweidimensionale, Superauflösung Rendering der Z-Ring aus der PALM Bildgebungsverfahren oben beschrieben erzeugt. Im Folgenden fassen wir qualitative und quantitative Informationen, die von ihnen gewonnen werden können. Qualitativ beobachteten wir, dass die Z-Ring ein unregelmäßiger Struktur, die mehrere Konfigurationen (einzelnes Band oder schraubenförmigen Lichtbogens), die nicht in herkömmlichen unterscheidbar Fluoreszenzbilder (verg...

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Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Wir beschreiben eine super-resolution imaging Methode, um die strukturelle Organisation des bakteriellen FtsZ-Ring, ein wesentlicher Vorrichtung zur Zellteilung zu untersuchen. Diese Methode basiert auf quantitativen Analysen von photoaktivierten Lokalisierungs-Mikroskopie (PALM) Bilder und kann auf andere bakterielle Proteine ​​des Zytoskeletts angewendet werden.

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

super-resolution-imaging-of-the-bacterial-division-machinery

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Aufrufe.  The Johns Hopkins University School of Medicine. Wir beschreiben eine super-resolution imaging Methode, um die strukturelle Organisation des bakteriellen FtsZ-Ring, ein wesentlicher Vorrichtung zur Zellteilung zu untersuchen. Diese Methode basiert auf quantitativen Analysen von photoaktivierten Lokalisierungs-Mikroskopie (PALM) Bilder und kann auf andere bakterielle Proteine ​​des Zytoskeletts angewendet werden.

Serie: Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Electron Cryotomography von Bakterienzellen

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Forschung

Biologie

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Testproben zur Optimierung STORM Super Resolution Mikroskopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Vorbereitung, Imaging und Quantifizierung der Bakterienoberfläche Motilität Tests

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Dreidimensionale Super Resolution Mikroskopie von F-Aktin durch interferometrische fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Anwendung des High-Speed-Höchstauflösung Geschwindigkeit Mikroskopie in Live primäre Zilie

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to chromatic aberration and the imperfect alignment of cameras, images acquired in each channel may be shifted, and magnified, as well as rotated relative to each other in any of the three dimensions. With the classical calibration method, chromatic shifts are measured by multicolor beads attached to the surface of a coverslip, and a number of software are available to measure the chromatic shifts from such calibration samples. However, chromatic aberration can vary with depth, change with observation conditions and be induced by the biological sample itself, thus hindering determination of the true amount of chromatic shift in the sample of interest and across the volume. Correcting chromatic shifts at higher accuracy is particularly relevant for super-resolution microscopy where only slight chromatic shifts may affect quantitative analyses and alter the interpretation of multicolor images. We have developed an open-source software Chromagnon and accompanying methods to measure and correct 3D chromatic shifts in biological samples. Here we provide a detailed application protocol that includes special requirements for sample preparation, data acquisition, and software processing to measure chromatic shifts in biological samples of interest.

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correction of chromatic shifts in three-dimensional (3D) multicolor fluorescence microscopy images is crucial for quantitative data analyses. This protocol is developed to measure and correct chromatic shifts in biological samples through acquisition of suitable reference images and processing with the open-source software, Chromagnon.