Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine optimierte Methode für die Hepatozytenisolierung bei Mäusen nach partieller Hepatektomie ohne die Notwendigkeit einer Dichtegradientenzentrifugation zu präsentieren. Wir sehen normalerweise einen großen Prozentsatz von lipidbeladenen Hepatozyten während der frühen Regeneration. Die steatotischen Hepatozyten, die normalerweise bei der Zentrifugation des Dichtegradienten aufgrund der geringen Dichte verloren gehen, bleiben bei diesem Protokoll erhalten.
Um die Perfusionsausrüstung vorzubereiten, schließen Sie eine 26-Gauge-IUI-Kanüle mit einem Luer-Lock-Anschluss an das Auslassende des Schlauchs an. Spülen Sie dann den Schlauch und führen Sie das Einlassende des Schlauches in das vorgewärmte Perfusionspufferrohr im Wasserbad ein. Grundieren Sie es mit warmem Perfusionspuffer bei einer Pumpengeschwindigkeit von drei Millilitern pro Minute.
Bevor Sie mit der Operation fortfahren, stellen Sie sicher, dass die Maus ausreichend betäubt ist. Reinigen Sie dann den Bauch mit einer chirurgischen Peelinglösung und 70% Ethanol. Schneiden Sie dann die Nähte ab, um den Mittellinienschnitt wieder zu öffnen, der zuvor für die partielle Hepatektomie gemacht wurde, und ziehen Sie die Wundränder vorsichtig auseinander.
Wenn die Hepatektomie älter als 24 bis 48 Stunden ist, entfernen Sie die Naht und schneiden Sie die Haut mit einer Schere oder einem Skalpell ab. Verwenden Sie einen Retraktor oder einfache Clips, um den Bauch offen zu halten. Die Bauchhöhle sollte so weit wie möglich freigelegt werden, um den Zugang und die Visualisierung zu optimieren.
Befestigen Sie eine 5-0-Polypropylennaht am Brustbein. Ziehen Sie es kranial und fixieren Sie es in dieser Position. Bewegen Sie den Darm mit sterilen Wattestäbchen nach rechts, um die Pfortader und die Hohlvene freizulegen.
Verwenden Sie ein feuchtes Tuch, um den Darm zu halten. Platzieren Sie einen schweren Gegenstand von etwa zwei Zentimeter Höhe, z. B. einen Metallgewichtsring, neben den Hinterbeinen der Maus. Legen Sie dann den Schlauch mit der angeschlossenen 26-Gauge-IUI-Kanüle auf das Objekt und positionieren Sie die Nadel vorsichtig auf der Hohlvene.
Passen Sie die Länge des Schlauchs nach Bedarf an. Die Kollagenase-Stammlösung wird in das vorgewärmte Aufschlusspufferrohr überführt. Bereiten Sie 10 bis 20 Milliliter Verdauungspuffer pro Tier vor.
Schalten Sie die Pumpe ein, nachdem Sie die Pumpendrehzahl auf drei Milliliter pro Minute eingestellt haben. Entsorgen Sie die ersten zwei bis drei Milliliter des vorgewärmten Perfusionspuffers, sobald der Puffer die Nadel erreicht. Um die Kanülierung der unteren Hohlvene durchzuführen, ziehen Sie die Hohlvene mit einem sterilen Wattestäbchen vorsichtig kaudal unter die Punktion, damit die bereitgestellte Spannung das Einführen der Kanüle in die Vene erleichtert.
Führen Sie die 26-Gauge-IUI-Kanüle in einem flachen Winkel in die untere Hohlvene unterhalb der Niere ein, während der Puffer durch die Nadel verläuft. Stellen Sie sicher, dass die Nadelfase nach oben zeigt. Suchen Sie in der Blitzkammer des Katheters nach Blut, wenn die Nadel in das Lumen eindringt.
Schieben Sie die Nadel weitere zwei bis drei Millimeter vor, um sicherzustellen, dass die Spitze des Katheters in die Vene eindringt. Schieben Sie den Kunststoffkatheter weitere fünf Millimeter über die Nadel und in die Hohlvene. Entfernen Sie die Nadel langsam und sehr vorsichtig.
Suchen Sie nach zwei bis drei Sekunden nach weißen Flecken, die sich in der Leber bilden, oder nach Schwellungen der Pfortader, was darauf hindeutet, dass der Perfusionspuffer durch die Leber fließt und aus der Zentralvene in die Leberläppchen gelangt. Warten Sie, bis die Pfortader innerhalb von ein bis zwei Sekunden sichtbar anschwillt, nachdem sich weiße Flecken auf der Leberoberfläche gebildet haben. Schneiden Sie die Pfortader mit einer Schere so distal wie möglich vom Leberhilus ab.
Erhöhen Sie die Flussrate auf vier bis sieben Milliliter pro Minute, abhängig vom Gewicht des Tieres, der Lebergröße und dem Ausmaß der anfänglichen Hepatektomie. Klemmen Sie die Pfortader sieben bis 10 Sekunden lang mit einer Pinzette oder einer Gefäßklemme fest. Stellen Sie sicher, dass keine Flüssigkeit durchläuft.
Führen Sie nach ca. 30 Sekunden eine zweite Klemme durch und sorgen Sie dafür, dass die Leber anschwillt und sich entspannt. Spülen Sie das Tier drei bis vier Minuten lang weiter und beobachten Sie, wie der klare Puffer aus der Pfortader fließt. Klemmen Sie die Pfortader für drei bis vier Sekunden fest, bevor der Verdauungspuffer die Leber erreicht.
Stellen Sie sicher, dass sich die Leber beim Lösen der Klemme entspannt und die Perfusionsflüssigkeit klar bleibt. Sobald der Verdauungspuffer die Leber erreicht, klemmen Sie die Pfortader erneut fest. Die Leber sollte sich nach dem Lösen der Klemme nicht entspannen.
Verdauen Sie etwa vier Minuten lang bei einer Flussrate von fünf Millilitern pro Minute. Achten Sie bei fortschreitender Verdauung auf Anzeichen dafür, dass die Leber anschwillt, und auf kleine transparente Abschnitte auf der Oberfläche der Leber. Beachten Sie, dass die Leber die Textur eines nassen Stoffes annimmt und fast matschig erscheint.
Untersuchen Sie die Konsistenz, indem Sie sie vorsichtig mit einem feuchten, sterilen Wattestäbchen berühren. Fahren Sie mit der Perfusion fort, bis ein deutlicher Unterschied in der Oberflächenstruktur der Leber beobachtet werden kann. Beachten Sie, dass die Leber eine sehr helle Farbe und ein sprudelndes Aussehen annimmt, was darauf hinweist, dass sich die Glisson-Kapsel vom Parenchym trennt.
Stoppen Sie die Verdauung, sobald die Leber diese Eigenschaften erworben hat. Entfernen Sie die Nadel, bevor die Luft in die Leber gelangt. Fassen Sie das zentrale Bindegewebe zwischen den Lappen mit einer Pinzette und heben Sie es leicht nach oben, indem Sie es als Ankerpunkt verwenden.
Schneiden Sie alle Verbindungen der Leber zu anderen Organen ab und entfernen Sie die Gallenblase. Entfernen Sie die Leber vorsichtig aus der Bauchhöhle. Seien Sie vorsichtig, da es in diesem Stadium dünn und zerbrechlich sein wird.
Legen Sie die Leber in den eiskalten Konservierungspuffer. Übertragen Sie die Leber in eine 10-Zentimeter-Petrischale und fügen Sie 10 Milliliter eiskaltes Williams'Medium E.Rupture the Glisson-Kapsel mit einer feinen Pinzette an einigen Stellen entlang der Leberoberfläche hinzu. Fassen Sie einen zentralen Teil mit zwei Pinzetten.
Ziehen Sie sie langsam auseinander, damit die Kapsel reißen kann, ohne die Hepatozyten zu beschädigen, und geben Sie die Zellen frei, indem Sie die Kapsel leicht schütteln. Filtern Sie fünf Milliliter Leberpulpe durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie den Filter mit 10 Millilitern frischem eiskaltem Medium aus und filtern Sie die restlichen fünf Milliliter Zellstoff durch das Zellsieb.
Schleudern Sie den Extrakt bei 50 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Saugen Sie den größten Teil des Überstands ab und lassen Sie einen Milliliter übrig, um die Zellen durch vorsichtiges Schwenken des Röhrchens zu resuspendieren. Fügen Sie 40 Milliliter kaltes Williams'E Medium hinzu und wiederholen Sie den Schritt dreimal.
Fahren Sie mit der Isolierung von Hepatozyten fort, wie im Textmanuskript beschrieben. Nach einer Hepatektomie von 70 % bei Mäusen betrug die endgültige Hepatozytenausbeute etwa 10 bis 15 x 10 bis 6 mit einer mittleren Lebensfähigkeit von 78 %. Nach einer verlängerten Hepatektomie von 86 % betrug die Hepatozytenausbeute vier bis neun x 10 bis 6 mit einer mittleren Lebensfähigkeit von 65 %.
Nach partiellen Hepatektomien zeigen Hepatozyten eine erhöhte Zellgröße im Vergleich zu normalen Lebern, die einem erhöhten Lipidgehalt entspricht. Ein erhöhter Lipidgehalt wurde in murinen Hepatozyten 24 Stunden nach partieller Hepatektomie beobachtet, was als Zunahme der Granularität oder direkt durch das Vorhandensein von Lipidvesikeln in vergrößerten Hepatozyten beobachtet wurde. Bei der klassischen Dichtegradientenreinigungsmethode gingen große Fetthepatozyten im Überstand verloren und nur kleinere magere Hepatozyten wurden im Zellpellet gesammelt.
Mit dem verbesserten Protokoll gingen die lipidgefüllten Hepatozyten nicht verloren und alle Hepatozyten wurden pelletiert. Die wiederholte Klemmung erleichtert den Spülvorgang. Damit wird die Leber optimal von verbliebenen Blutbestandteilen befreit, die die Verdauungsenzyme hemmen könnten.
