Das Protokoll ermöglicht es den Forschern, gleichzeitig die Kalziumantwort in primären T-Zellen zu messen und gleichzeitig ihre Untergruppe und ihren Oberflächenphänotyp zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Notwendigkeit vermeidet, bestimmte Untergruppen von Zellen zu isolieren, bevor ihre Kalziumreaktionen untersucht werden. Bereiten Sie zunächst eine Stammlösung von Indo-1 AM von einem Mikrogramm pro Mikroliter vor, indem Sie 50 Mikroliter DMSO in eine Durchstechflasche mit 50 Mikrogramm Indo-1 AM geben. Verdünnen Sie die Stammlösung auf ein geeignetes Volumen cRPMI und eine Konzentration von sechs Mikrogramm pro Milliliter.
Stellen Sie das Medium in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie dann dieses Medium, um eine zuvor hergestellte Zellsuspension im Verhältnis eins zu eins zu verdünnen, um fünf bis 6 Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten. Als nächstes fügen Sie zu einer 12-Well-Gewebekulturplatte einen Milliliter Zellsuspension pro Well und Versuchsbedingung hinzu.
Bereiten Sie eine einzelne gefärbte Kontrollprobe für kalziumfreies Indo-1 vor, indem Sie EGTA zu den mit Farbstoffen beladenen Indo-1-Zellen hinzufügen. Bereiten Sie eine Vertiefung für die biologische Negativkontrolle ohne Fluorophore oder Indo-1-Farbstoff vor. Bereiten Sie eine Indo-1-Positivkontrolle vor, indem Sie Ionomycin in einer Konzentration von 50 Mikromol zur farbstoffbeladenen Zellsuspension am Durchflusszytometer hinzufügen.
Bereiten Sie auch eine Vertiefung für die Kontrolle einzelner Färbungen für zusätzliche Zellpopulationen mit Antikörper-konjugierten Fluorophoren vor. Fügen Sie dann zwei Mikrogramm FC-Rezeptor-blockierenden Antikörper pro Million Zellen hinzu und inkubieren Sie die Platte 45 Minuten lang, wobei alle 15 Minuten abgeklopft wird, um die Zellen zu resuspendieren. Mischen Sie nach der Inkubation das gesamte Zellvolumen von der Platte und geben Sie es in 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Zentrifugieren und Dekantieren des Überstands. Sobald die Zellen mit einem Milliliter vorgewärmtem cRPMI gewaschen sind, pelletieren Sie erneut und dekantieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter cRPMI und inkubieren Sie jedes Röhrchen, wobei die Oberseite des Röhrchens für den Gasaustausch leicht geöffnet bleibt, um eine vollständige Entesterung der intrazellulären AM-Ester zu ermöglichen.
Als nächstes bereiten Sie eine Mastermischung aus allen benutzerdefinierten Fluorochrom-konjugierten Antikörpern vor und geben sie für einen Milliliter des Zellvolumens zu den ruhenden Zellen. Nach der Ruhezeit pelletieren Sie die Zellen und waschen Sie das Pellet, indem Sie es in einem Milliliter cRPMI, das auf vier Grad Celsius gekühlt ist, resuspendieren. Wiederholen Sie diesen Schritt und legen Sie die Röhrchen auf Eis.
Resuspendieren Sie einzelne Proben in 500 Mikrolitern phenolrotfreiem cRPMI unter Verwendung eines Fünf-Milliliter-Polystyrol-Durchflussrohrs mit einer Kappe. Um die Temperatur mit Hilfe der Kalziumflussanalyse zu halten, bereiten Sie ein Perlenbad vor, indem Sie Badeperlen in ein kleines Wasserbad geben und auf 37 Grad Celsius erwärmen. Schneiden Sie vorsichtig ein 50-Milliliter-Chronikröhrchen in zwei Hälften und entsorgen Sie die Oberseite des Röhrchens.
Füllen Sie das restliche Röhrchen zu drei Vierteln mit Badeperlen und lassen Sie es im Perlenbad 37 Grad Celsius erreichen. Stellen Sie das Perlenbad zusammen mit einem Styroporgestell in die Nähe eines Durchflusszytometers, um das Röhrchen zu positionieren. Vor der Analyse am Durchflusszytometer erwärmen Sie die Röhrchen einzeln sieben Minuten lang auf 37 Grad Celsius.
Melden Sie sich bei der Durchflusszytometer-Software an und klicken Sie auf die Registerkarte Bibliothek. Wählen Sie dann fluoreszierende Tags aus, um kalziumgebundenes Indo-1 und kalziumfreies Indo-1 hinzuzufügen. Wählen Sie dann UV-Laser unter Fluoreszenz-Tag-Gruppen aus und klicken Sie auf Hinzufügen, um einen fluoreszierenden Tag-Namen hinzuzufügen.
Wählen Sie die Laseranregung und die Emissionswellenlänge aus und klicken Sie dann auf Speichern. Fahren Sie mit dem Versuchsaufbau fort. Klicken Sie auf die Registerkarte Akquise, Öffnen/Erstellen eines neuen Experiments und fügen Sie dem Experiment die gewünschten fluoreszierenden Tags hinzu.
Erstellen Sie eine Referenzgruppe und eine neue Stichprobengruppe für das Experiment, und beschriften Sie beide Gruppen. Stellen Sie auf der Registerkarte "Erfassungen" die Ereignisse auf das Maximum von 10 Millionen, das Stoppvolumen auf das maximale Volumen von 3000 Mikrolitern und die Stoppzeit auf das Maximum von 36.000 Sekunden ein. Erfassen Sie einfach gefärbte Kontrollen für benutzerdefinierte konjugierte Antikörper, die im Multicolor-Panel enthalten sind, und für den funktionellen Indo-1-Farbstoff.
Fügen Sie 50 Mikromol Ionomycin zur kalziumgebundenen Indo-1-Positivkontrolle hinzu und wirbeln Sie vor. Fügen Sie das Durchflussrohr zur Probeninjektionsplatine hinzu und klicken Sie auf Aufzeichnen. Fügen Sie dann die kalziumfreie Indo-1-Negativkontrolle zum Durchflusszytometer hinzu und klicken Sie auf Aufzeichnen.
Entmischt die einzelnen Stained-Regler, indem Sie auf die Schaltfläche Unmix klicken. Sobald die Entmischung abgeschlossen ist, erstellen Sie sequenzielle Diagramme mit dem ungemischten Arbeitsblatt, z. B. SSC-A im Vergleich zu FSC-A, um Schmutz aus der Probe zu entfernen, und SSC-A im Vergleich zu SSC-H, um Dubletten zu entfernen. Erstellen Sie dann Tore, indem Sie auf Plotten klicken.
Fügen Sie dem Arbeitsblatt ein Diagramm hinzu, und doppelklicken Sie in das Tor, um eine nachgelagerte geschlossene Population zu erstellen. Fahren Sie fort, bis alle interessierenden Populationen berücksichtigt sind. Als nächstes erwärmen Sie die zuvor vorbereiteten einzelgefärbten Kontrollproben auf 37 Grad Celsius für die sequenzielle Analyse.
Richten Sie die Durchflusszytometrie-Software ein und lassen Sie DI zwei bis drei Minuten lang in Eiswasser laufen, um die fluidische Stabilität des Durchflusszytometers zu gewährleisten. Richten Sie sequenzielle Diagramme auf dem ungemischten Arbeitsblatt ein, indem Sie mit den Schaltflächen Polygonrechteck oder Ellipsentor Tore erstellen, um die gewünschte Grundgesamtheit einzubeziehen. Doppelklicken Sie in das Tor und ändern Sie die Parameter für die y- und x-Achse in SSC-A statt SSC-H.
Schließen Sie die Definition der Achsenparameter ab, indem Sie mit der linken Maustaste auf die Achse klicken. Erstellen Sie ein Diagramm mit SSC-A im Vergleich zum Viabilitätsfarbstoffsignal. Gate die lebenden Zellen, die negativ für die Aminfarbstofffärbung sind.
Lebende Zellen, die für die Lebendtotfärbung negativ sind, gruppieren sich sowohl auf der y- als auch auf der x-Achse an der Nullmarkierung. Doppelklicken Sie auf das innere Diagramm, um ein neues Diagramm zu erstellen, das nur einzellige lebende Lymphozyten enthält. Ändern Sie die Y-Achse in Indo-1 über der Zeit auf der x-Achse, um den Kalziumeinstrom zu visualisieren.
Als nächstes legen Sie die erwärmte biologische Probe in den SIT der Maschine. Führen Sie die Proben mit 2.500 bis 3000 Ereignissen pro Sekunde bei einer mittleren Flussrate durch, um den Kalziumeinstrom in einer begrenzten Anzahl von Zellpopulationen zu visualisieren. Geben Sie das nächste Röhrchen in das Perlenbad zur Erfassungskontrolle.
Drücken Sie die Aufnahmetaste, um die Ausgangsdaten 30 Sekunden lang aufzuzeichnen und einen basalen Calcium-Signalspiegel in der Probe zu erhalten. Klicken Sie dann auf Stopp und entfernen Sie das Röhrchen aus dem Probeninjektionsanschluss. Geben Sie 30 Mikrogramm unkonjugiertes Anti-CD3 direkt in das Probenröhrchen, um den Kalziumeinstrom einzuleiten.
Setzen Sie das Röhrchen schnell wieder auf den Probeninjektionsanschluss und drücken Sie in der Software auf Aufnahme. Zeichnen Sie sieben Minuten lang Daten auf und beobachten Sie, wie viel Zeit unter den Erfassungssteuerungen in der Software verstrichen ist. Drücken Sie dann in der Software auf Stopp.
Fügen Sie ein Mikrogramm pro Milliliter Ionomycin hinzu und zeichnen Sie es 30 Sekunden lang auf, um das maximale Kalziumsignal in den interessierenden Zellen zu erhalten. Fahren Sie mit der nächsten Probe fort und wiederholen Sie den Arbeitsablauf, bis alle Proben gesammelt wurden. Speichern Sie das Experiment und klicken Sie auf die Export-Zip-Datei.
Ungemischte Dateien werden in eine externe Durchflusszytometrie-Analysesoftware hochgeladen. Ein stabiles, konsistentes Signal in einem Diagramm von Zeit und Seitenstreuung deutete auf fluidische Stabilität hin. Die Lymphozytenpopulation wurde durch eine anschließende Unterscheidung von Einzelstücken in einem Diagramm der Seitenstreuhöhe über der Fläche kontrolliert.
Die Singuletts wurden auf ihre Lebensfähigkeit hin untersucht. Anschließend wurde das Gating auf die CD19-negative Population angewendet. Diese T-Zell-Subpopulationen wurden mit Antikörpern gegen CD4 und CD8 untersucht, indem die kalziumgebundene Indo-1-Fluoreszenz über die Zeit visualisiert wurde.
In einzelnen Zellpopulationen zeigte das Diagramm des kalziumgebundenen Indo-1 über der Zeit einen Ausgangswert vor der Stimulation. Eine Spitzenreaktion, wenn der intrazelluläre Kalziumspiegel abnahm und die Kalziumantwort durch Zugabe von Ionomycin ausgelöst wurde. Vor der Zugabe von Anti-CD3-Antikörpern wurde ein schwaches Calcium-gebundenes Indo-1-Signal detektiert.
Während der Peakantwort zeigten die Zellen ein starkes kalziumgebundenes Indo-1-Signal und reduzierten kalziumfreies Indo-1. Fünf Minuten nach dem Höhepunkt kehrte die Indo-1-Fluoreszenz fast zum Ausgangswert zurück. Nach Zugabe von Ionomycin konnte ein robustes Signal von Calcium-gebundenem Indo-1 sichtbar gemacht werden, das auf eine adäquate Farbbeladung der Zellen hinweist.
Die Analyse der seltenen Populationen wurde durchgeführt, indem kalziumgebundenes Indo-1 im Vergleich zu kalziumfreiem Indo-1 nach Gating auf jede interessierende Population aufgetragen wurde. Und die Analyse der Kalziumantwort über den gesamten Zeitverlauf für jede Teilmenge. Der Kalziumfluss unter Verwendung von Vollspektrumprofilen kann zu einer durchflusszytometrischen Analyse mit hohen Parametern in einer Vielzahl von Immunsubpopulationen führen.
Die hochdimensionale Analyse für ein unverzerrtes Clustering von T-Zell-Subpopulationen kann in Kombination mit Hochparameter-Durchflusszytometrie für erweiterte Analysen verwendet werden. Diese Technik wurde für die Analyse mehrerer Immunsubpopulationen in Verbindung miteinander in einer Massenprobe entwickelt.
