Mehr als 50% der Darmkrebspatienten entwickeln Lebermetastasen durch Pfortaderverbreitung. Und aktuelle Tiermodelle zur Untersuchung von Lebermetastasen bei Darmkrebs reichen nach wie vor nicht aus, um den biologischen Prozess zu rekapitulieren. Die Portalveneninjektion von Darmkrebstumoroiden bietet eine fibroblastenreiche Tumorumgebung, die die Untersuchung des Übersprechens zwischen metastasierenden Krebszellen und CAS bei Darmkrebs-Lebermetastasen ermöglicht.
Diese Technik bietet eine Plattform zur Beurteilung der Wirksamkeit therapeutischer Strategien, die auf die Tumormikroumgebung der Lebermetastasierung von Darmkrebs abzielen. Diese Methode ist besonders nützlich, um Wechselwirkungen zwischen CAS, Tumorzellen und der Tumormikroumgebung zu untersuchen. Wenn die Baumwollspitze nicht richtig an der Injektionsstelle platziert wird, kann es nach der Nadelentfernung zu übermäßigen Blutungen kommen.
Das Einweichen der Baumwollspitze stoppt, sobald sich die Injektionsstelle befindet. Die Identifizierung der Pfortader und die Visualisierung der Injektionsstelle können ohne visuelle Demonstration dieses Verfahrens schwierig sein. Bereiten Sie zunächst einen aseptischen Operationsbereich mit sterilen Vorhängen auf einem Heizkissen vor.
Bereiten Sie außerdem alle für die Operation erforderlichen Instrumente vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Beleuchten Sie dann den Operationsbereich, indem Sie die Position der Lichtquelle anpassen. Als nächstes injizieren Sie subkutan 0,1 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht Buprenorphin in eine Maus zur chirurgischen Schmerzbehandlung.
Dann betäuben Sie die Maus und rasieren Sie mit einem Elektrorasierer die Mitte bis zum Oberbauch in einem Bereich, der vom aseptischen Operationsbereich entfernt ist, um zu vermeiden, dass Haare die Stelle kontaminieren. Reinigen Sie die Inzisionsstelle abwechselnd mit Betadin und 80% Ethanol, um den Operationsbereich zu sterilisieren. Wiederholen Sie dies dreimal.
Legen Sie die Maus im Operationsbereich auf ein Heizkissen in Rückenlage mit Isofluran-Anästhesie-Erhaltung. Legen Sie dann einen chirurgischen Vorhang mit einem Loch über den Bauch. Heben Sie die Bauchhaut mit einer Pinzette an und machen Sie einen zwei bis drei Zentimeter großen Hautschnitt an der Mittellinie mit einer Schere, schneiden Sie nur die Haut ab und stellen Sie sicher, dass der Schnitt vom Mittelbauch bis zum xiphoiden Prozess des Brustbeins reicht und nicht über dem unteren Ende des Xiphoidprozesses.
Dann heben Sie die Peritonealwand mit einer Pinzette vollständig an und machen Sie mit der Schere einen ähnlichen zwei bis drei Zentimeter großen Schnitt zum Peritoneum. Vermeiden Sie es, den Darm und das Zwerchfell zu schneiden. Als nächstes tränken Sie eine chirurgische Gaze mit warmer Kochsalzlösung und legen Sie sie neben den Schnitt auf der rechten Seite des Chirurgen.
Ziehen Sie den Dünn- und Dickdarm vorsichtig mit einem mit Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen heraus und legen Sie sie auf die salzhaltige Gaze. Bedecken Sie den Darm mit zusätzlicher nasser Gaze, um ihn feucht zu halten. Als nächstes ziehen Sie den Darm vorsichtig mit der nassen Gaze nach rechts zum Chirurgen.
Wenden Sie dann eine sanfte Spannung an, um die Pfortader zu visualisieren. Wenn die Visualisierung der Pfortader schwierig ist, passen Sie die Position des Magens vorsichtig mit einem nassen Wattestäbchen an. Nachdem Sie die tumoroide Suspension mehrmals vorsichtig verrohrt haben, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten, ziehen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in eine Hamilton oder eine Milliliterspritze, die an einer 33-Gauge-Nadel befestigt ist, um Luftblasen zu vermeiden.
Führen Sie die Nadelfase langsam mit einer Einführtiefe von drei bis vier Millimetern und dem Nadelwinkel fast parallel zur Pfortader in die Pfortader ein. Injizieren Sie die Tumorzellen langsam über 30 Sekunden, um einen Verschluss der Pfortader zu verhindern. Die Farbe der Leber ändert sich vorübergehend von Rot zu Weiß.
Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel langsam und üben Sie sofort fünf Minuten lang mit einem trockenen Wattestäbchen einen sanften Druck auf die Injektionsstelle aus. Entfernen Sie den Wattestäbchen und tragen Sie sofort einen hämostatischen Schwamm auf die Injektionsstelle auf. Halten Sie den Schwamm mit einer Wattestäbchen oder einer Pinzette fest und üben Sie noch fünf Minuten lang sanften Druck aus.
Entfernen Sie nach fünf Minuten den Druck auf den hämostatischen Schwamm und bestätigen Sie, dass keine Blutungen von der Injektionsstelle vorliegen. Wenn Blutungen auftreten, führen Sie sofort eine Druckhämostase mit einem Wattestäbchen für etwa 10 Minuten durch. Tragen Sie dann einen zusätzlichen hämostatischen Schwamm für weitere fünf Minuten auf.
Nachdem Sie bestätigt haben, dass keine Blutungen vorliegen, entfernen Sie die chirurgische Gaze am Darm. Dann spritzen Sie mit einer Spritze, die mit fünf Millilitern Kochsalzlösung gefüllt ist, die Kochsalzlösung in den Darm, um eine Organadhäsion zu verhindern. Legen Sie den Darm vorsichtig zurück in die Bauchhöhle und nähen Sie das Peritoneum mit 4-0 Polyglactin-Nähten.
Heben Sie dann beide Seiten der Haut mit einer Pinzette an, wenden Sie Hauthefter an, um den Hautschnitt zu schließen, und achten Sie darauf, den Darm nicht zu klammern. Schalten Sie das Isofluran aus, aber halten Sie den Sauerstofffluss am Laufen. Überwachen Sie die Maus sorgfältig.
Und wenn die Maus erwacht, legen Sie sie in einen leeren Käfig auf einem Heizkissen. Überwachen Sie die Maus, bis sie bei Bewusstsein ist und normal schlendert. Vier Stunden nach der Operation subkutan 0,1 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin injizieren.
Überwachen Sie die Maus eine Woche lang täglich sorgfältig, überprüfen Sie die Nähte und die Wundheilung. Sieben bis 10 Tage nach der Operation entfernen Sie die Hauthefter mit einem Hefterentferner. RNA-in-situ-Hybridisierung zwei Wochen nach der Injektion der Schwanzvene AAV-8 Islr zeigte eine Überexpression der Islr in der Leber.
Zwei Wochen nach der AAV mRuby2-Injektion wurden einzellige Suspensionen von Darmkrebs-Organoiden in die Vena des Mausportals injiziert. Makroskopisch führte diese Pfortaderinjektion zu mehreren weißen Tumorknoten in der Leber. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung der durch die Pfortveneninjektion induzierten Lebermetastasen des Dickdarmkrebses zeigte eine Histopathologie des mäßig differenzierten tubulären Adenokarzinoms, begleitet von einer desmoplastischen Stromareaktion und Nekrose.
Diese stromareiche Histologie rekapitulierte getreu die der menschlichen Darmkrebs-Lebermetastasen, so dass sich dieses Modell für die translationale Forschung zur Untersuchung des metastasierenden Tumorstromas eignet. Die Immunhistochemie für Alpha-glattes Muskelaktin bestätigte das Vorhandensein von krebsassoziierten Fibroblasten, während die rote Picro-Sirius-Färbung eine reichliche extrazelluläre Matrix im Tumormesenchym zeigte. Die Immunchemie für EPCAM ergab, dass der metastasierende Darmkrebs eine Tumorknospe zeigte, die ein Merkmal für eine schlechte Prognose von Darmkrebs ist.
Und der Ki67-Markierungsindex betrug ungefähr 80%, was darauf hindeutet, dass die meisten Tumorzellen mitotisch aktiv sind. Die Mäuse zeigten ein medianes Überleben von 57 Tagen nach der tumoroiden Injektion in die Pfortader. AAV-8 Islr-behandelte Mäuse zeigten ein verbessertes Überleben der Maus, verringerte In-vivo-Bildgebungssignale von Tumoren, verstärkte die morphogenetische Proteinsignalisierung des Knochens und verringerte die Ki67-proliferierenden Zellen.
Stellen Sie sicher, dass die Baumwollspitze auf die richtige Injektionsstelle aufgetragen wird und der hämostatische Schwamm erst aufgetragen wird, nachdem die Blutung aufgehört hat. Die Tumoretablierung kann mit Hilfe der IVIS-Bildgebung überwacht werden, um sicherzustellen, dass Tumorzellen in der Leber wachsen.
