Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis oder EAE ist ein Tiermodell, das zur Entwicklung neuer und verbesserter Behandlungen für Patienten mit multipler Sklerose verwendet wird. Die Induktion von Krankheiten bei EAE erfordert eine perfekte Öl- und Wasseremulsion, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Die hier vorgestellte Methode der Emulsionsherstellung ist frei von menschlichen Einflüssen, wodurch Inkonsistenzen von einem Versuch zum anderen begrenzt werden.
Obwohl die Methode für EAE optimiert wurde, kann sie auch für andere Autoimmunerkrankungsmodelle und auch zum Testen von Krebsimpfstoffen verwendet werden. Zur Herstellung der CFA-Aufschlämmung werden 100 Milligramm gefriergetrocknete M-Tuberkulose H37 RA und fünf 3,2 Millimeter Stahlperlen zu einem Sieben-Milliliter-Rohr hergestellt. Schütteln Sie das Röhrchen im Homogenisator 60 Sekunden lang bei höchster Geschwindigkeitseinstellung.
Fünf Milliliter IFA-Adjuvans in die Tube geben und erneut 60 Sekunden bei höchster Geschwindigkeit schütteln. Dann die Aufschlämmung mit einer Pipette in ein frisches Röhrchen geben, die Perlen zurücklassen und bei vier Grad Celsius bis zum Gebrauch lagern. Um eine CFA/Peptid-Emulsion herzustellen, laden Sie die erste Zusatzdatei herunter, um die für jedes Reagenz benötigte Menge zu berechnen.
Legen Sie dann das verschraubte Rohr und die zu verwendenden Reagenzien auf Eis. Als nächstes fügen Sie die Emulsionskomponenten hinzu. Zuerst PBS, dann das Peptid, die CFA-Aufschlämmung.
Und schließlich die IFA. Verschließen Sie den Schlauch mit der Kappe fest, indem Sie ihn mehrmals festziehen und lösen. Schütteln Sie das Röhrchen 5 bis 10 Sekunden lang kräftig von Hand, um die Reagenzien vorzumischen.
Legen Sie das Röhrchen in den Schüttelhomogenisator und sichern Sie es mit dem Stab. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf die höchste Einstellung und die Zeit auf 60 Sekunden ein. Sobald der Lauf beendet ist, legen Sie die Röhre für drei Minuten auf Eis und wiederholen Sie den Lauf noch ein oder zwei Mal mit den gleichen Einstellungen.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 G aus einer Minute, um eingeschlossene Luft zu entfernen und die Emulsion zu verdichten. Entfernen Sie die Kappe aus dem Röhrchen. Führen Sie den Kolben in das Röhrchen ein und drücken Sie ihn langsam nach unten, bis er die Oberseite der Emulsion erreicht.
Entfernen Sie das Schnappgehäuse an der Unterseite des Röhrchens, indem Sie es drehen. Als nächstes entfernen Sie den Kolben von allen Injektionsspritzen und fügen Sie den Injektionsspritzen eine Nadel hinzu. Befestigen Sie dann die Rückseite der Injektionsspritze an dem dafür vorgesehenen Schloss am Boden des Röhrchens und verriegeln Sie es mit einer kurzen Drehung.
Übertragen Sie die Emulsion aus dem Röhrchen in die Injektionsspritze, indem Sie den Kolben vorsichtig drücken. Stoppen Sie, wenn die Emulsion die 0,15-Milliliter-Graduierung der Injektionsspritze erreicht hat. Trennen Sie die Injektionsspritze vom Schlauch und führen Sie den Kolben vorsichtig ein, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luft in diese Spritze gelangt.
Drücken Sie den Kolben, bis die Emulsion aus der Nadel kommt, und wiederholen Sie den Vorgang für den Rest der im Röhrchen vorhandenen Emulsion. Um die Größe der Wasser- und Ölpartikel zu analysieren, fügen Sie einen winzigen Tropfen der Emulsion zu einem Objektträger hinzu, schmieren Sie ihn mit einem Abdeckschlicker aus und drücken Sie dann hart in einer kreisförmigen Bewegung, um die Emulsion abzuflachen. Untersuchen Sie die verschmierte Emulsion unter einem Phasenkontrastmikroskop mit 400-facher Vergrößerung und fokussieren Sie auf ein Feld mit einer Monoschicht der Emulsion.
Stellen Sie sicher, dass kleine, gleichmäßige, graue oder weiße Partikel sichtbar sind. Emulsionen, die durch die Homogenisierungsmethode hergestellt wurden, zeigten graue oder weiße bohnenförmige Partikel, die winzige Tröpfchen von Wasser- und Ölemulsionen darstellten. Im Gegensatz dazu waren die mit der Spritzenmethode hergestellten Emulsionströpfchen größer und breiter.
Bei der Wirbelmethode wurden große graue oder schwarze Partikel beobachtet, die Luftblasen entsprechen, die in der Emulsion eingeschlossen sind. Änderungen in der Partikelgrößenverteilung im Laufe der Zeit, die mit einem Laserdefraktions-Partikelgrößenanalysator für Wasser- und Ölemulsionen gemessen wurden, zeigten keine Änderung der Partikelgröße über einen Zeitraum von sechs Wochen. Die frischen 3 Wochen alten und 15 Wochen alten Emulsionen induzierten alle ähnliche EAE-Erkrankungen bei allen Tieren, die während des gesamten Experiments getestet wurden.
Mäuse entwickelten in allen Experimenten ein ähnliches Krankheitsbild und zeigten, dass die hier vorgestellte Homogenisierungsmethode Emulsionen erzeugte, die EAE konsistent und reproduzierbar induzierten. Bevor Sie die Emulsion für ein Experiment herstellen, laden Sie die Zusatzdatei Nummer eins herunter, um die Menge jeder Komponente zu berechnen, die zur Minimierung des Abfalls benötigt wird. Mit der hier vorgestellten Methode könnte die Emulsionspräparation nicht nur für die präklinische Forschung, sondern zukünftig auch für die Herstellung von Krebsimpfstoffen in der Klinik standardisiert werden.
