Um einen besseren Einblick in die Zusammensetzung und Struktur des Plexus choroideus zu erhalten, ist eine effiziente Methode zur Isolierung des Plexus choroideus aus den Hirnventrikeln ein erster unschätzbarer Schritt. Mit dieser Mikrodissektionstechnik ist es möglich, den Plexus choroideus aus den Hirnventrikeln zu sezieren und gleichzeitig seine Funktion, Lebensfähigkeit und Struktur einzudämmen, ohne den Plexus choroideus mit dem umgebenden Gewebe zu kontaminieren. Eine wesentliche Hürde bei der Isolierung des Plexus choroideus ist die Identifizierung der Struktur, da sie noch in den Hirnventrikeln schwimmt.
Die Färbung des Plexus choroideus mit Bromphenolblau erleichtert die Isolierung. Elien Van Wonterghem, unser Laborleiter, wird das Verfahren vorführen. Beginnen Sie mit der Herstellung eines terminalen Anästhetikums, einer transkardialen Perfusionslösung und einer Lösung, die für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) erforderlich ist, und anderen Lösungen, wie im Text erwähnt.
Um das Mäusegehirn zu isolieren, bringen Sie das unheilbar betäubte Tier in die dorsale Dekubitusposition und fixieren Sie die Maus, indem Sie die Gliedmaßen auf eine Platte nageln. Desinfizieren Sie den Brustkorb, indem Sie 70%iges Ethanol aufsprühen, bevor Sie mit einer chirurgischen Klinge aus Kohlenstoffstahl einen Schnitt von etwa vier Zentimetern direkt unter dem Zwerchfell machen. Öffnen Sie die Haut und legen Sie den Brustkorb mit einer chirurgischen Schere frei.
Schneiden Sie das Zwerchfell vollständig auf und trennen Sie den Brustkorb, um die Lunge und das schlagende Herz freizulegen. Mit einer Perfusionspumpe wird die Maus mit 10 Millilitern der Perfusionslösung mit einer Rate von 4,5 Millilitern pro Minute transkardial. Führen Sie eine 26-Gauge-Nadel in die linke Herzkammer ein, um die Lösung in den Systemkreislauf zu pumpen.
Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere den rechten Vorhof ab, damit das Blut aus dem Kreislauf entweichen kann. Nach der Enthauptung der Maus schneiden Sie die Kopfhaut auf, indem Sie einen Schnitt machen, der zwischen den Ohren beginnt und über den Augen liegt. Ziehe die Haut seitlich heraus, um den Schädel freizulegen.
Schneiden Sie dann den Schädel auf, indem Sie den Plattenepithelnähten in Richtung des Nasenteils folgen. Wenn Sie fertig sind, legen Sie das Gehirn in eine eiskalte Petrischale und geben Sie einen Milliliter eiskaltes PBS in das Gehirngewebe. Um den im vierten Ventrikel schwimmenden Aderhautplexus zu isolieren, schneiden Sie das Kleinhirn mit einem Skalpell vorsichtig vom Großhirn ab.
Entfernen Sie die verbleibenden Teile des Hirnstammgewebes aus dem Kleinhirn. Drehen Sie das Gehirn so, dass die Schnittlinie nach oben zeigt, und achten Sie darauf, dass die vierte Ventrikelhöhle in der Mitte des Schnitts sichtbar ist und der Plexus choroideus an der dorsalen Stelle liegt. Öffnen Sie bei Bedarf die Herzkammer, indem Sie mit einer scharfen Pinzette am Bindegewebe ziehen.
Reißen Sie den Plexus choroideus vorsichtig mit einer winzigen scharfen Pinzette aus der Ventrikelwand. Um den Plexus choroideus vom seitlichen Ventrikel zu isolieren, schneiden Sie das Gehirn mit einer winzigen scharfen Pinzette in zwei Hemisphären. Drehen Sie eine Gehirnhälfte so, dass die Schnittlinie nach oben zeigt.
Um den Seitenventrikel freizulegen, ziehen Sie die Hirnrinde sanft vom Thalamus weg. Ziehen Sie den Hippocampus bis zur mittleren sagittalen Schnittlinie zurück. Der laterale Ventrikel ist nun sichtbar, wobei der Plexus choroideus am unteren Ende des Ventrikels liegt.
Öffnen Sie bei Bedarf die Herzkammer, indem Sie das Bindegewebe mit einer scharfen Pinzette aufziehen. Verwenden Sie eine winzige scharfe Pinzette, um den Plexus choroideus vorsichtig aus der Ventrikelwand zu reißen. Um die Probenvorbereitung für das REM durchzuführen, wird der frisch isolierte Aderhautplexus in eine frisch hergestellte Fixationslösung überführt und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert.
Danach waschen Sie die Probe dreimal mit drei bis fünf Millilitern 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer für jeweils fünf Minuten. Die Proben werden 30 Minuten lang in drei bis fünf Millilitern 2%Osmiumtetroxid in 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer fixiert. Anschließend waschen Sie die Proben dreimal für jeweils fünf Minuten mit drei bis fünf Millilitern Reinstwasser.
Als nächstes werden die Proben in einer zunehmenden Reihe von eiskalten Ethylalkoholkonzentrationen mit 15 Minuten pro Ethylalkohollösung dehydriert. Verwenden Sie einen Trockner an kritischen Punkten, um die Probe richtig zu trocknen. Positionieren Sie die Probe sorgfältig auf einer Probenhalterung mit einem Kohleaufkleber und visualisieren Sie die Proben des Aderhautplexus mit REM.
Das vorliegende Protokoll ermöglichte die effiziente Isolierung des Plexus choroideus vom lateralen und vierten Ventrikel des Mausgehirns. Die Perfusion mit Bromphenolblau führte zur Visualisierung des Plexus choroideus. Wenn Bromphenolblau in den weiteren Verarbeitungsschritten nicht zugelassen war, wurde eine Perfusion mit PBS-Heparin oder keine Perfusion zur Verarbeitung durchgeführt.
Die morphologische REM-Analyse der Oberfläche von Zellen des Plexus choroidecleus (CPE) zeigt deutlich die zweiarmige Struktur des vierten Ventrikels und die typische C-förmige Form des Plexus choroideus lateralis, die aus dem lateralen Ventrikel isoliert ist. Eine höhere REM-Vergrößerung zeigte vesikelartige Strukturen auf der apikalen Seite von CPE-Zellen und Mikrovilli, was darauf hindeutet, dass morphologische Veränderungen der CPE-Zellen unter Krankheitsbedingungen mit Hilfe von REM untersucht werden können. Es ist wichtig, nur das Gewebe des Plexus choroideus zu berühren und herauszunehmen, um die Probe nicht mit dem umgebenden Gewebe zu kontaminieren.
Seien Sie vorsichtig, um die Struktur des Plexus choroideus zu erhalten. Eine Vielzahl von nachgeschalteten Techniken kann auf den isolierten Plexus choroideus angewendet werden, um seine Struktur und Funktion zu untersuchen, von der Mikroskopanalyse über die Transkriptomanalyse bis hin zur Durchflusszytometrie. Die Mikrodissektion des Plexus choroidoid aus dem Gehirn ermöglicht es uns, einen besseren Einblick in die Struktur und Funktion dieses winzigen Hirngewebes zu erhalten.
Dieses Wissen ist unerlässlich, um seine Rolle bei neurologischen Erkrankungen besser zu verstehen.
