Dieses Protokoll, für das alle experimentellen Bedingungen sorgfältig optimiert wurden, kann verwendet werden, um eine erfolgreiche und effiziente chemische Konjugation des DEC-205-Antikörpers zum OVA-Antigen zu ermöglichen. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie eine flexible Auswahl des Proteinantigens und des Antikörpers ermöglicht und nicht auf eine genetische Fusion dieser Komponenten angewiesen ist. Wir haben dieses Protokoll auch verwendet, um Konjugate von Hepatitis-C-Virusproteinen und Anti-DEC-205 für das In-vivo-DC-Targeting zu erzeugen.
Dies könnte auch für Anti-Tumor-Impfansätze wertvoll sein. Um mit der Anti-DEC-205-Produktion zu beginnen, resuspendieren Sie ein Milliliter-Volumen von ein bis fünf Millionen aufgetauten kryokonservierten NLDC 145-Zellen in neun Millilitern 37 Grad Celsius ISF-1-Medium, ergänzt mit 1% Penicillin und Streptomycin, und säen Sie die Zellen in einen 25 Quadratzentimeter-Zellkulturkolben zur Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 bis 48 Stunden. Wenn die Zellen 70% Konfluenz erreichen, übertragen Sie die gesamte Zellsuspension in ein 15 Milliliter konisches Rohr und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Resuspendieren Sie das Pellet in 12 Milliliter frisches komplettes 37 Grad ISF-1 Medium und platten Sie die Zellen in einem 75 Quadratzentimeterkolben neu. Nach 48 bis 72 Stunden Kultur wird die 70%ige Konfluentkultur auf jeweils zwei neue 75 Quadratzentimeterkolben aufgeteilt und jedem Kolben sechs Milliliter frisches komplettes ISF-1 Medium zugesetzt. Wenn die Kulturen 70% Konfluenz erreichen, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zellkulturkolbenböden und Kulturoberflächen mit der Zellsuspension zu spülen, um alle Zellen zu sammeln und 10 Milliliter jeder expandierten NLDC 145-Zellsuspension in einzelne PETG-Walzenflaschen zu übertragen.
Dann geben Sie 140 Milliliter komplettes ISF-1 Medium zu jeder Walzenflaschenkultur und kultivieren Sie die Walzenflaschen bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 25 Schuss pro Minute für drei Tage. Für die Antikörperreinigung aus dem NLDC 145-Überstand das Ende eines Siliziumrohrs in das mit Überständen gefüllte Becherglas geben und 800 Milliliter Überstand tropfenweise durch eine Protein G Sepharose-Säule laufen lassen. Zur Elution fügen Sie 100 Mikroliter 1,5 molare Tris-HCL in jedes der zwanzig zwanzig 1,5 Milliliter-Röhrchen hinzu und entfernen Sie den Gummistopfen aus der Säule.
Einen Milliliter 0,1 molares Glycin in die obere Kammer der Säule geben und den eluenthaltigen Antikörper in eines der vorbereiteten 1,5 Milliliter röhrchen sammeln und für jedes Röhrchen wiederholen. Wenn alle Antikörper gesammelt und die antikörperhaltigen Elutionen gepoolt wurden, schließen Sie den Boden eines 20 Zentimeter langen Dialyseschlauchs mit einem geeigneten Dialyseschlauchverschluss und pipettieren Sie die Antikörperelution vorsichtig in den Schlauch. Schließen Sie die Oberseite des Dialyseschlauchs mit einer zweiten Klemme und befestigen Sie die obere Klemme des Dialyseschlauchs an einem schwimmenden Ständer.
Fügen Sie einen magnetischen Rührstab zu einem Becher pbS hinzu und legen Sie das Becherglas auf einen Magnetrührer. Öffnen Sie nach der nächtlichen Dialyse bei vier Grad Celsius eine Klemme, um das komplette Dialysat auf einen Zentrifugalkonzentrator mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 10 Kilo zu laden, und zentrifugieren Sie den Konzentrator für 30 Minuten bei 693 mal G und vier Grad Celsius. Am Ende des Spins wird der Zentrifugalkonzentrator mit 10 Milliliter PBS für eine zweite Zentrifugation belastet, bis ein letztes bis 1,5 Milliliter Volumen Antikörperlösung erhalten ist.
Um OVA an den Anti-DEC-205-Antikörper zu konjugieren, fügen Sie 200 Mikroliter PBS, ergänzt mit 500 Mikrogramm OVA-Protein, 240 Mikroliter einer frisch zubereiteten TCEP-HCL-Lösung und 560 Mikroliter steriles Reinstwasser in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen für eine 1,5-stündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Gleichzeitig 2,5 Milligramm Anti-DEC-205 in 900 Mikroliter PBS und 100 Mikroliter frisch zubereitetes Sulfo-SMCC in ein zweites 1,5-Milliliter-Röhrchen für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius bei 550 Umdrehungen pro Minute in einem Heizblock geben. Legen Sie am Ende der Inkubationen Entsalzungssäulen mit gelösten Kappen und abgedrehten Böden in einzelne konische 15-Milliliter-Rohre und zentrifugieren Sie die Säulen, um die Flüssigkeit zu entfernen.
Nach der Zentrifugation legen Sie die Säulen in neue Röhrchen mit entfernten Kappen und laden Sie die Antikörper-Sulfo-SMCC- und OVA TCEP-HCL-Lösungen langsam in die Mitte des kompakten Harzbettes von einer Säule pro Lösung. Nach dem Zentrifugieren die Säulen entsorgen und die Antikörper- und OVA-Lösungen sofort mit schonender Pipettung mischen. Laden Sie die Anti-DEC-205/OVA-Lösung auf einen zentrifugalen Proteinkonzentrator und füllen Sie den Konzentrator mit PBS auf ein Volumen von 15 Milliliter.
Zentrifugieren Sie den Konzentrator für fünf Minuten bei 2.000 mal G und Raumtemperatur und füllen Sie den Konzentrator mit weiteren 10 Millilitern PBS. Nachdem Sie die Konzentration mindestens acht Minuten lang unter den gleichen Zentrifugenbedingungen zentrifugiert haben, sammeln Sie die konzentrierte Probe vorsichtig aus der oberen Kammer. Um den Erfolg der Konjugation durch Western-Blot-Analyse zu überprüfen, laden Sie ein Aliquot aus jeder Probe auf einem Proteinstandard auf ein SDS-Gel und führen Sie das Gel gemäß den Standard-SDS-PAGE-Analyseprotokollen aus.
Färben Sie die Membranen nach dem Gel-Blotting mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Antikörpern, um Anti-DEC-205 oder OVA gemäß Standardprotokollen nachzuweisen. Die Membranen können dann auf das Vorhandensein des jeweiligen Proteins in jeder Probe analysiert werden. Um den Erfolg der Konjugation durch ELISA zu überprüfen, beschichten Sie eine geeignete 96-Well-ELISA-Platte mit 100 Mikrolitern des Anti-OVA-Antikörpers pro Well und verdünnen Sie Anti-DEC-205/OVA in einem Verhältnis von ein zu zwei und einem Blockierungspuffer, um Verdünnungen von sechs Mikrogramm pro Milliliter auf 93,8 Nanogramm pro Milliliter zu erhalten.
100 Mikroliter jeder Verdünnung in die entsprechenden Vertiefungen der antikörperbeschichteten Platte für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur geben. Am Ende der Inkubation werden 100 Mikroliter Meerrettichperoxidase-konjugierter Antikörper gegen das Anti-DEC-205/OVA-Konjugat für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur in die Platte gegeben und dann 50 Mikroliter Meerrettichperoxidase-Substrat in jede Vertiefung gegeben, um die Analyse der Farbreaktion durch Spektrophotometrie zu ermöglichen. Die parallele Western-Blot-Analyse kann verwendet werden, um sowohl konjugierte OVA als auch konjugierte Anti-DEC-205 nachzuweisen.
Die Färbung für OVA würde den Nachweis von überschüssiger freier OVA ermöglichen, falls vorhanden, und die Färbung für Anti-DEC-205 überprüft den Erfolg der Konjugation durch eine Erhöhung des Molekulargewichts zwischen nacktem Anti-DEC-205 und dem Konjugat. ELISA kann auch verwendet werden, um den Erfolg der Konjugation mit einer positiven Assoziation zwischen dem nachgewiesenen Signal und der analysierten Proteinmenge zu bewerten, was auf die erfolgreiche Erzeugung von Anti-DEC-205 / OVA-Konjugant hinweist. Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzanalyse zeigen deutlich, dass der Anti-DEC-205-Kern effizient aus dem Knochenmark stammende CD11c-positive Zellen bindet.
Die Impfung mit Anti-DEC-205/OVA in Verbindung mit Adjuvans induziert einen Anstieg der OVA-spezifischen IgG-Titer bei Mausempfängern im Vergleich zur Impfung mit OVA und Adjuvans allein. Darüber hinaus induziert Anti-DEC-205/OVA effizient überspezifische CD4- und CD8-positive T-Zell-Antworten, wobei die Anti-DEC-205/OVA-induzierten CD8-positiven T-Zell-Antworten die durch OVA allein induzierte signifikant übertreffen. Für eine erfolgreiche Konjugation des OVA-Antigens mit dem Anti-DEC-205-Antikörper ist es wichtig, die Materialien wie nachgewiesen vorzubereiten und die Konjugationsschritte unter konsistenten Bedingungen durchzuführen.
Nach erfolgreicher Konjugation des Antigens und des Antikörpers sind zahlreiche nachfolgende Ansätze möglich, darunter die Bindungsanalyse und die Induktion einer pathogen- oder tumorbedingten Immunität in vivo.
