Dieser Artikel beschreibt hauptsächlich eine kostengünstige Methode zur Präparation von Pflanzenproben und zur Bildgebung mit DESI-MSI und kann die Nachteile von trockenem Gewebe überwinden, das beim Einblasen von Stickstoff leicht bricht. Die Wurzel wurde auf dem Kryostat-Mikrotom kryoseziert, während das Blatt durch Prägung präpariert wurde, was eine teure Maschine erfordert oder an Signalintensität verliert. Unsere Methode kann diese Einschränkungen überwinden.
Diese Methode kann in der räumlichen Metabolomik von Pflanzen verwendet werden, z. B. bei der Verteilung und Bewegung von Giftstoffen in Pflanzen, die unter abiotischem und biotischem Stress stehen. Nehmen Sie zunächst gereinigte Wurzeln und Blätter einer zweijährigen Salvia miltiorrhiza-Pflanze und schneiden Sie sie direkt in einer Querschnittsdicke von etwa drei bis fünf Millimetern auf. Kleben Sie die Probe dann mit doppelseitigem Klebeband auf einen Objektträger des Haftmikroskops.
Legen Sie einen weiteren Objektträger über die Probe und wickeln Sie sie wie ein Sandwich mit einer Siegelfolie ein. Als nächstes frieren Sie die Sandwich-Probe mindestens vier Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius ein und setzen sie dann zwei Stunden lang einem Luftvakuum mit der eingeschlossenen Temperatur von minus 75 bis minus 82 Grad Celsius und einem Vakuummeter von 2,5 bis 3,7 Pascal aus. Für die Analyse bringen Sie die Proben nach der Entnahme aus dem Kühllager in einem Exsikkator auf Raumtemperatur, um Kondensation auf der Probenoberfläche zu vermeiden, bevor die Probe einer Matrixanwendung unterzogen wird.
Implementieren Sie die Einrichtung des Detektors und die Massenkalibrierung des Geräts im Elektrospray-Ionisations- oder ESI-Modus. Führen Sie den Detektoraufbau mit Leucin und Cephalin in Wasseracetonitril im Verhältnis eins zu eins durch und führen Sie eine Massenkalibrierung mit Natriumformiat und Wasserisopropanol im Verhältnis eins zu eins durch. Nehmen Sie die ESI-Quelle heraus und montieren Sie die DESI-Einheit auf dem Massenspektrometer.
Schließen Sie die Stickstoffgasversorgung an die DESI-Einheit an und stellen Sie den Gasdruck auf etwa 0,5 Megapascal ein. Füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit Leucin und Cephalin und Ameisensäure in Wassermethanol im Verhältnis eins zu neun und befestigen Sie die Spritze an der Hochleistungsspritzenpumpe, um Lösungsmittel für die Ionisierung der Chemikalien in der Probe bereitzustellen. Befestigen Sie anschließend eine lösungsmittelliefernde Kapillare an der Spritze und dem DESI-Sprühgerät.
Die lösungsmittelliefernde Kapillare ist eine Standardkapillare mit Abmessungen von 75 Mikrometern Innendurchmesser und 375 Mikrometer Außendurchmesser. Starten Sie die Spritzenpumpe und stellen Sie die Infusionsrate auf zwei Mikroliter pro Minute ein, um einen konstanten Durchfluss und Sprühnebel des Lösungsmittels zu erhalten. Schalten Sie das Stickstoffgasventil aus und nach ca. 15 Sekunden wieder ein.
Ein kleiner Tropfen Lösungsmittel bläst auf die Bühne und der Sprühnebel ist zu sehen, wenn sich der Lösungsmittelfluss in einem konstanten Zustand befindet. Passen Sie als Nächstes die Position des Sprühgeräts in Bezug auf den Sprühwinkel, die XYZ-Achse, den Vorsprung und die Höhe an. Verwenden Sie rote und schwarze Marker als Referenzen, um das massenspektrometrische Signal zu optimieren, um eine Signalintensität von etwa eins mal 10 bis zur Quinte im Empfindlichkeitsmodus zu erhalten.
Da der Vorsprung des Sprühgeräts der wichtigste Faktor ist, der die Signalintensität beeinflusst, stellen Sie den Vorsprung ein, indem Sie den Stickstoffgasschutz mit einem Fünf-Millimeter-Schraubenschlüssel wechseln. Die Sprührichtung beeinflusst die Qualität des Massenbildes. Drehen Sie daher das Sprühgerät, bis der Sprühstrahl gerade ist.
Nach all diesen Schritten ist das Setup bereit für Experimente und nach der Ersteinrichtung in der Regel für etwa drei Wochen nutzbar. Für die DESI-MS-Bildgebung ist keine Probenvorbehandlung erforderlich. Entfernen Sie jedoch nach Möglichkeit die überschüssigen Medien auf den Objektträgern.
Nehmen Sie ein Bild der Probe auf dem Objektträger auf. Legen Sie den Objektträger, ohne die Probenoberfläche zu berühren, um Verunreinigungen zu vermeiden, auf die Plattenposition des DESI-Tisches, der über zwei Plattenpositionen, A und B, verfügt.Verwenden Sie Standardobjektträger oder einen Vollobjektträger, um in die Position zu passen. Eine Vollrutsche bietet Platz für bis zu vier Objektträger und hat somit eine viel größere Fläche für Experimente.
Öffnen Sie die High-Definition-Massenbildverarbeitungssoftware. Legen Sie auf der Registerkarte Erfassen eine neue Platte fest, und wählen Sie die richtige Plattenposition (A oder B) und den Plattentyp aus. Wählen Sie auf der Seite "Bildauswahl" die vier Ecken der Folie aus, und das Bild wird dann automatisch an die richtige Ausrichtung angepasst.
Um die MS-Parameter einzustellen, wählen Sie als Experimenttyp den üblicherweise verwendeten DESI-MS-Modus aus, in dem nur das Mutterion detektiert wird. Wählen Sie als Nächstes die Polarität entweder positiv oder negativ aus, da das Gerät in einem Experiment nur eine Polarität verwenden kann. Wenden Sie dann den Empfindlichkeitsmodus an, um mehr Informationen über Chemikalien in kleinen Mengen zu erhalten.
Zeichnen Sie als Nächstes ein Rechteck, um den Scanbereich auf der Registerkarte Muster zu definieren, und legen Sie die Pixelgröße fest, indem Sie die X- und Y-Größen des Pixels gleich halten. Stellen Sie die Scanrate auf nicht mehr als das Fünffache der Pixelgröße ein. Speichern Sie das Projekt und exportieren Sie ein Arbeitsblatt für die MS-Erfassungssoftware.
Importieren Sie als Nächstes das Arbeitsblatt in die MS-Erfassungssoftware und speichern Sie es als neue Probenliste. Drücken Sie Start Run, um das Scannen von MS-Images zu starten, und mehrere Bilder können der Experimentwarteschlange hinzugefügt werden, indem weitere Arbeitsblätter importiert werden. Laden Sie die Datendatei der Probe in die Massenbildverarbeitungssoftware und stellen Sie die Parameter für die DESI-Bildverarbeitung ein.
Da Leucin und Cephalin für die interne Schleusenmasse verwendet wurden und die Schleusenmasse der einzige Punkt ist, um die Polarität des Experiments zu bestimmen, ist es wichtig, die richtige Schleusenmasse einzustellen. Stellen Sie 556.2772 für den positiven Modus und 554.2620 für den negativen Modus ein. Um eine Liste der Zielchemikalien zu erstellen, laden Sie die verarbeitete Datendatei, um das DESI-Bild der Probe zu visualisieren.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Normalisierung, um die Daten durch Totalionenchromatographie zu normalisieren, um die relative Intensität einer bestimmten Chemikalie zur Referenz zu erhalten, und dann können verschiedene Proben miteinander verglichen werden. Zeichnen Sie einen Bereich of Interest (ROI) und kopieren Sie mehrere Kopien auf das Beispielbild. Wählen Sie dann alle ROIs aus und exportieren Sie die multivariate Analyse, um MS-Informationen aus allen ROIs zu extrahieren.
Die massenspektrometrische Bildgebung der Wurzel- und ganzen Blattabschnitte zeigt die räumliche Verteilung der ausgewählten Verbindungen. Die Farbe jedes einzelnen Pixels repräsentiert die relative Intensität des Masse-Ladungs-Verhältnisses und kann somit mit der natürlichen Verteilung und der Häufigkeit des Metabolitenions in der gesamten Probe in Verbindung gebracht werden. Die Verteilung der Zielverbindungen, Tanshinon IIA und Rosmarinsäure, ist in verschiedenen Bereichen der Wurzel sichtbar.
Die Verbindung Tanshinol A wurde in den Blattabschnitten nachgewiesen. Als Protokoll, das auf Reproduzierbarkeit abzielt, ist es am wichtigsten, die Signalintensität zu optimieren, indem die Position des Sprühgeräts in mehreren Dimensionen angepasst wird.
